磷酸钙细胞转染试剂盒的应用

背景^[1-3]

磷酸钙细胞转染试剂盒在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性。用磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。

HEK293或HEK293T细胞，即通常所谓的293细胞，是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达90%以上；通常很容易达到40-50%左右的转染效率。

大多数常见的细胞例如Hela细胞、CHO细胞等也都适合磷酸钙法转染，但效率比293细胞要略低一些。磷酸钙细胞转染试剂盒不仅适合于大多数贴壁细胞的转染，也适用于一些悬浮细胞的转染。磷酸钙细胞转染试剂盒提供的试剂都经无菌处理，可以直接使用。

操作步骤

1传代细胞准备细胞在转染前24h传代,待细胞密度达50%～60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培养液培养细胞。

2　DNA沉淀液的准备首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于μL无菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。

3用巴斯德吸管在500μL　2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。

4室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。

5将沉淀逐滴均匀加入10cm平板中，轻轻晃动。

6在标准生长条件下培养细胞4～16h。除去培养液，用5ml　1×HeBS洗细胞2次，加入10ml完全培养液培养细胞。收集细胞或分入培养皿中选择培养。

应用^[4][5]

用于人iPS细胞的诱导及诱导体系的优化研究

对人iPS细胞的诱导体系进行了一系列优化，提供了一个操作简单，无需复杂仪器，花费不高的方案，具体研究内容及结果如下：采用磷酸钙法和QuickShuttle转染试剂对慢病毒载体(FU-tet-o-hSox2、FU-tet-o-hOct4、FU-tet-o-hc-Myc、FU-tet-o-hKLF4、FUdeltaGW-rtTA)和逆转录病毒载体pEYK E4进行病毒包装并测定病毒滴度，同时研究不同包装体系、不同转染时间、有无明胶包被三个方面对使用磷酸钙法制备病毒和QuickShuttle转染试剂制备病毒的影响。

从以上三方面设计正交实验摸索转染条件。结果表明，不论是通过磷酸钙法制备病毒还是QuickShuttle转染试剂制备病毒，使用pLP1、pLP2和pLP/VSVG的3质粒包装体系，并将转染的293T细胞铺在用明胶包被的培养皿上，然后转染72h可获得较理想的结果，其中，磷酸钙转染法获得的病毒滴度为600TU/mL，QuickShuttle试剂转染法获得的病毒滴度可达7130000TU/mL。

使用单细胞培养法和组织块培养法原代培养了hFFCs和MEFs，结果表明，通过组织块培养法获得的原代细胞的细胞形态更好，且传代后极少出现悬浮的死细胞。将MEFs用丝裂霉素C处理后，成功制备了饲养层细胞。将hFFCs用病毒感染并观察其形态变化。

参考文献

[1]New perspectives on the biology of fragile X syndrome[J].Tao Wang,Steven M Bray,Stephen T Warren.Current Opinion in Genetics&Development.2012(3)

[2]Modeling Parkinson’s Disease Using Induced Pluripotent Stem Cells[J].Blake Byers,Hsiao-lu Lee,Renee Reijo Pera.Current Neurology and Neuroscience Reports.2012(3)

[3]LRRK2 Mutant iPSC-Derived DA Neurons Demonstrate Increased Susceptibility to Oxidative Stress[J].Ha Nam Nguyen,Blake Byers,Branden Cord,Aleksandr Shcheglovitov,James Byrne,Prachi Gujar,Kehkooi Kee,Birgitt Schüle,Ricardo E.Dolmetsch,William Langston,Theo D.Palmer,Renee Reijo Pera.Cell Stem Cell.2011(3)

[4]Highly Efficient miRNA-Mediated Reprogramming of Mouse and Human Somatic Cells to Pluripotency[J].Frederick Anokye-Danso,Chinmay M.Trivedi,Denise Juhr,Mudit Gupta,Zheng Cui,Ying Tian,Yuzhen Zhang,Wenli Yang,Peter J.Gruber,Jonathan A.Epstein,Edward E.Morrisey.Cell Stem Cell.2011(4)

[5]程腾.人iPS细胞的诱导及诱导体系的优化[D].内蒙古科技大学,2014.