大鼠气道平滑肌细胞说明及培养

背景^[1]

大鼠气道平滑肌细胞分离自气管组织，气道平滑肌是气管的重要结构组成之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。气道平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。气道平滑肌细胞的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键。

特性^[1]

形态特性：成纤维细胞样

生长特性：贴壁生长  

培养条件：DMEM(高糖)+10%FBS

传代方法：1:3传代；2~3天1次。

冻存条件：无血清细胞冻存液

污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

细胞培养 ^[1]

复苏细胞：

1. 将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2. RASMCs大鼠气道平滑肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

主要参考文献

[1] 王宇 孙婧 金融 梁宜 刘艳艳 尹磊淼等； 针刺对哮喘大鼠气道重建模型气道平滑肌细胞T型钙通道蛋白表达的影响。Chinese Acupuncture & Moxibustion