雷帕霉素的制备

背景及概述^[1][2]

雷帕霉素(Rapamycin)现称为西罗莫司(Sirolimus)，是1975年由Veniza等分离得到的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)所产的大环内脂类抗生素。经过多年的研究雷帕霉素现已被开发成为临床使用的强效免疫抑制剂。同时以雷帕霉素为前体，化学修饰合成所得的一些结构新颖衍生物，被发现在免疫抑制、抗癌、抗帕金森氏症与艾滋病等方面上，具有新的治疗作用，其中其合成物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作为抗肿瘤靶向新药物进行临床研究，雷帕霉素在医药应用领域具有广泛前景。

雷帕霉素

制备^[2]

当前雷帕霉素的生产主要通过发酵法生产，如中国发明专利申请公布书CN101486976A所述一般西罗莫司发酵效价只有200μg/ml左右，发酵副产物较多，导致后序提取时的层析分离比较困难，工作较为复杂，酵培养的发酵液经过滤得菌体后经甲醇萃取浓缩后，再通过一系列纯化工艺如色谱层析、萃取、结晶等获得西罗莫司纯品，产品收率低于20％。所以该说明书公开了一种吸水链霉菌及其应用的技术方案，提供了一种高单位的西罗莫司产生菌，效价为600μg/ml以上，但是产品收率只达到了30～35％。

CN102443012A公布了一种高纯度提取纯化方法a.用丙酮或乙醇抽提发酵液过滤后得到的菌丝体，得到抽提液后，真空浓缩得浓缩抽提液；b.用乙酸乙酯萃取发酵液过滤后得到的上清液，分离乙酸乙酯相得萃取液，真空浓缩得浓缩萃取液；c.将a中的浓缩抽提液和b中的浓缩萃取液合并得浓缩液，并加入到装有大孔树脂的床层进行吸附，用丙酮和水的混合溶液作为洗涤剂洗涤大孔树脂，收集洗脱液并真空浓缩，得浓缩洗脱液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的浓缩洗脱液，经无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水后真空浓缩得浓缩液，上样硅胶柱进行层析分离，正庚烷和丙酮混合溶液作为洗涤剂洗涤硅胶柱，正庚烷和丙酮混合溶液作为洗脱剂洗脱硅胶柱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；e.将步骤d得到的浓缩液溶于石油醚或乙醚中结晶，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空浓缩后用乙醚重结晶，干燥得到雷帕霉素纯品。

杨国新等在《海峡药学》(2007年，第19卷第17期，25-26页)文献中公开：发酵液经离心后得到菌丝体，菌丝体用两倍量体积的95％酒精分别浸泡两次，离心弃菌丝渣，合并酒精浸泡液，减压浓缩去除酒精。残留液用等体积的乙酸乙酯分别萃取两次，合并乙酯层并用饱和NaCl溶液洗涤1次，经无水Na2SO4干燥1h后，过滤，减压浓缩除去乙酸乙酯得上柱物。上柱物溶于适当体积的洗脱剂(乙酯-石油醚洗脱系统)，200～300目硅胶柱层析，分段收集，HPLC检测，合并含西罗莫司的洗脱液，减压浓缩，浓缩液经乙醚结晶，洗晶，结晶。经上述制备的西罗莫司结晶溶于少量的洗脱剂，硅胶(200～300目)柱层析分离，分部收集，分离过程用高效液相跟踪检测。合并含西罗莫司的洗脱液，减压浓缩，浓缩液经乙醚结晶，洗晶，重结晶得高纯度西罗莫司样品。

美国专利公布说明书US20100029933A1公布了雷帕霉素的纯化技术方案，该方案从发酵液中纯化得到纯品纯度达到98.8％，总杂质含量小于1.2％，单杂低于0.15％，提纯方案为a)用疏水性溶剂萃取发酵液中的雷帕霉素并浓缩b)加入亲水性的溶剂分离杂质；c)将步骤得到的产物吸附到惰性载体上，用碱和酸连续洗涤，然后洗脱；d)收集步骤c得到的洗脱液或直接用步骤b中含雷帕霉素的溶液，上硅胶柱，收集洗脱液；e)将步骤d)得到的产物结晶；f)溶解f步骤中的结晶品，进行疏水作用或反相色谱；并将g重结晶得到的高哦纯度的雷帕霉素但是利用该方法纯化收率不高，在一个具体实例中可以得知11kg的雷帕霉素发酵液最后的纯品只有6g，称取3g纯品进一步纯化结晶得到2.5g。

朱健等在中国医药工业杂志发表的文章《他克莫司产生菌的选育和生产工艺研究》中公开了采用发酵液板框所得菌体丙酮浸泡，抽提液浓缩或加水稀释使丙酮浓度<50％(V/V)，用大孔吸附树脂吸附，低浓度的丙酮解析，再以高浓度丙酮解析。浓缩脱除丙酮，雷帕霉素不溶于水而形成沉淀，沉淀用乙醇溶解后结晶。初次结晶得到的纯度约为90％，乙醇重结晶1～2次后，纯度可提高至95％。

藤泽药业工业公司(徐亲民.他克莫司的工业化研究[J].国外医药抗生素分册,2000,21(4):151-155)报道采用主要工艺为收集菌丝体，丙酮浸泡，浓缩，经过Diaion HP20树脂处理，洗脱液浓缩后乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后经过酸性硅胶柱层析，再次经普通硅胶层析，最后通过乙腈重结晶得到产品。

主要参考资料

[1] 郝俊, 曹国番, 杨洁, 杨懿铭, 李振华, & 杨燕等. (2012). 雷帕霉素对人cd4+cd25+调节性t细胞体外扩增的影响. 现代免疫学, 032(005), 404-411.

[2] 杨震坤, 沈卫峰, 张瑞岩, 张建盛, 胡健, & 张奇等. (2006). 雷帕霉素洗脱支架治疗冠状动脉慢性完全性闭塞病变. 中国循环杂志, 021(002), 110-112.

[3] 陆莉, & 林志彬. (2001). 一种新型的免疫抑制剂--雷帕霉素. 中国药学杂志, 036(009), 643-645.