碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)的成分组成和操作步骤

背景及概述^[1]

碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI磷酸盐水解，释放出磷酸不萘酚，后者不偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色，碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。

组成^[1]

操作步骤^[1]

一、涂片或切片

1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蜡切片无需固定)，水洗。

2、滴加配制好的碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)，放入湿盒中，避光孵育15～20min，水洗。

3、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。

4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。

二、贴壁培养细胞

1、取6孔板或其他容器培养的细胞，弃液，PBS清洗干净

2、加入碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。

3、滴加配制好的碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)，放入湿盒中，避光孵育15～20min，PBS清洗。

4、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。

5、PBS清洗、镜检。

染色结果^[1]

ALP活性部位蓝色

细胞核红色(核固红)或绿色(甲基绿)

血液、骨髓涂片

注意事项^[1]

1.血液或骨髓细胞涂片或其他样本均应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。

2.培养细胞染色操作过程中，清洗、染色等步骤都应轻微，以免损伤或丢失细胞。

3.ALP孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。

4.复染时，核固红染色液或甲基绿染色液二者取其一。

5.每次染色时，应有阳性对照片。

主要参考资料

[1]碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)操作说明