真菌基因组DNA快速提取试剂盒

概述^[1-2]

试剂盒是一种将测定一种成分所需要的2种或2种以上的试剂及实验室一般用品连同操作说明书包装在一起，形成商品化的试剂单位，即由厂家提供给用户使用的一种套装试剂，使用者除用自备的蒸馏水或试剂盒提供的缓冲液进行复溶试剂的操作外不需要作任何试剂配制。目前检测试剂已广泛采用这一方式提供，kit的应用不但节约人力减少配制误差，而且有利于试剂质量的保证和实验室间方法学的统一，提高了可比性。

真菌基因组DNA快速提取试剂盒对经典的SDS裂解液进行了改良，并使用高浓度的蛋白变性剂，大大提高了裂解的效率，缩短了裂解的时间。无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂。从100mg新鲜大型真菌（如蘑菇）样品中可以获得1.5~5µgDNA，OD260/OD280比值一般为1.7~1.9。抽提得到的DNA可用于酶切、PCR、文库构建、Southernblot等相关实验。

注意事项^[2]

1．次使用真菌基因组DNA快速提取试剂盒前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入.

2．BufferFP1、BufferP3低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

3．避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

标准抽提步骤^[2]

自备材料：水浴锅、小型高速离心机（离心力≥12，000×g）、1.5ml离心管、无水乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇、RNaseA(10mg/ml)等。试剂盒初次开启，按瓶身标签说明在PWSolution中加入相应量的异丙醇混匀、WashSolution中加入相应量的无水乙醇混匀，在瓶身做好标记。于室温密封保存（18mlPWSolution加入12ml异丙醇，7.5mlWashSolution加入22.5ml无水乙醇；36mlPWSolution加入24ml异丙醇，15mlWashSolution加入45ml无水乙醇）。每次使用前请检查BufferDigestion是否出现沉淀，如有沉淀，请于56°C溶解后使用。

1.取50-100mg新鲜大型真菌（如蘑菇）或20mg干燥的子实体或菌丝用液氮研磨成粉末，加入1.5ml离心管中。加入200µlBufferDigestion和2µlβ-巯基乙醇，再加入20µlProteinaseK溶液，震荡混匀。56°C水浴1h至细胞完全裂解。水浴过程中，每10min颠倒混匀一次，可促进样品裂解。如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20µl的RNaseA（10mg/ml），室温放置2~5min。

2.加入100µlBufferPF，充分颠倒混匀，-20°C冰箱放置5min。

3.室温10，000rpm离心5min，将上清转移到新的1.5ml离心管中。

4.加入200µlBufferBD，充分颠倒混匀。ü加入BufferBD后，如有沉淀产生，可70°C水浴10min。

5.加入200µl的无水乙醇，充分颠倒混匀。

6.将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10，000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。

7.将吸附柱放回收集管，加入500µlPWSolution，10，000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。使用前注意溶液中是否按比例加入异丙醇。

8.将吸附柱放回收集管，加入500µlWashSolution，10，000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇。

9.将吸附柱重新放回收集管中，于12，000rpm室温离心2min，离去残留的WashSolution。ü将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的WashSolution，WashSolution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。

10.取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50µlTEBuffer静置3min，12，000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20°C保存。

主要参考资料

[1] 协和医学词典

[2] 真菌基因组DNA提取试剂盒说明书