葡聚糖凝胶G-75的应用

背景及概述^[1][2]

葡聚糖凝胶G-75呈白色微球状，多孔凝胶类型；结构成分：交联右旋糖酐；粒径： 40-120µm；工作PH值：2-10。葡聚糖凝胶G-75是一种分离试剂，层析介质。应用：利用分子筛作用，进行多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定。操作温度：4-40℃；球蛋白分离范围：3000-80000。

化学稳定性^[2]

葡聚糖凝胶G-75不溶于一切溶剂(除非它被化学降解)。 它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖昔键被水解。 长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。

物理稳定性^[2]

葡聚糖凝胶G-75并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。 干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。

应用^[1]

CN99116406.7公开了蕲蛇酶及其生产工艺，工艺为冻干蛇毒用已知的缓冲液溶解上葡聚糖凝胶G-75柱过滤,收集具有凝血酶样酶活力的A、B峰,用DEAE-葡聚糖凝胶A-50柱层析，收集具有凝血酶样酶活力的V、VI、VII峰，用CM-葡聚糖凝胶C-50柱层析，收集具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3峰，用superdex75PG柱过滤，各得a，b两峰，收集具有高凝血酶样酶活力的b峰，混合为分子量24000~30000道尔顿及等电点4.5~5.0的蕲蛇酶。

使用方法^[2]

1. 葡聚糖凝胶预处理：

在室温下，将葡聚糖凝胶干粉浸泡于蒸馏水中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，或者用热水浸泡（不建议煮沸）至少1小时直至充分溶胀，凝胶体积不再变化。

注：在溶胀前，加入蒸馏水搅拌后使其自然沉降，沉降后若上层溶液中漂浮的凝胶碎片颗粒较多，需要重复多次漂洗将其除去，防止层析时阻塞凝胶柱，影响流速。

2. 装柱：

将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层; 装柱要均匀，可在凝胶耐受的操作压下装柱，装好的凝胶柱可以检测柱效，检测过滤柱装填是否合格。

凝胶层析分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度：分级分离时，一般需要 100cm 左右长的层析柱，柱高与直径之比为 20:1-100:1，柱高过高时，凝胶挤压变形阻塞会引起较大的反压，应当尽可能避免；分组分离（例如脱盐）时用短柱，柱高控制在40-50cm 以下，柱高与直径的比约为 5:1-10:1。

3. 平衡：

上样前用平衡液平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（例如流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值）；

4. 上样：

分级分离时上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整;脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积。

样品溶液如有杂质或沉淀应过滤或离心除去，样品的粘度不能过高，否则影响分离效果。

5. 洗脱方法:

可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱缓冲液中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；

6. 在位清洗(CIP)

凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。 方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向清洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。

7. 保存

凝胶柱暂时不用，可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，可加入0.02%叠氮化钠防腐或用20%乙醇浸泡，以控制微生物生长。

主要参考资料

[1] CN99116406.7蕲蛇酶及其生产工艺

[2] 葡聚糖凝胶G-75产品介绍