肉毒毒素的制备

概述^[1]

肉毒毒素(botulinum toxin)是肉毒杆菌(Clostridum botulinum)病毒产生的一种蛋白质，非可逆地附在突触前神经终端，以抑制神经接合部分泌乙醯胆碱，从而阻止肌肉的收缩，即起肌肉松弛的效果。另外，肌肉被露在毒素后2天之内在其外侧开始造出附随的无髓鞘神经分支，这些神经分支在肌肉纤维的周围形成新的肌肉神经接合。

肉毒毒素是人类知晓的最致命的自然生物学作用剂。肉毒毒素的定量注入，例如利用在以提供肌肉麻痹而治疗过于敏感的骨骼肌为特征的神经肌肉性障碍，并以A型肉毒毒素治疗的症状有面部痉挛、成人疾病痉挛性斜颈、肛裂、眼睑痉挛、脑性麻痹、颈部肌张力异常、偏头痛、斜视、颞颚关节障碍及各种肌肉痉挛等。近来使用在如皱纹、面部肌肉痉挛、收缩治疗及面部整形等。

制备^[2]

介导的肉毒毒素凝胶剂的制备

取1 g卡波姆940，加蒸馏水适量，搅拌均匀后放置充分溶胀，得卡波姆凝胶溶液，然后取10单位的A型肉毒毒素，加入2 mL PBS缓冲液中，得到A型肉毒毒素溶液，然后采用固相合成法合成穿膜肽R8（8聚精氨酸），取1 g R8（8聚精氨酸）穿膜肽，溶解于2 mL PBS缓冲液中，得R8（8聚精氨酸）穿膜肽溶液。将5 g丙二醇、10 g乙醇加入至上述卡波姆凝胶中，边加边搅拌，以三乙醇胺调pH至6.0~7.0，再以蒸馏水加至约90 g时，将A型肉毒毒素PBS溶液和R8穿膜肽PBS溶液加入至凝胶中，充分搅拌混匀后，以蒸馏水加至100 g，即得A型肉毒毒素凝胶剂。

肉毒毒素的仿生矿化加工方法，包括以下步骤：

S1，将2g/100ml的甲基纤维素溶液、2g/100ml的羧甲基纤维素钠溶液、2g/100ml的明胶溶液按照1:3:1的体积比例混合均匀，得到生物基保护液，其中每100ml的明胶溶液中添加10g蔗糖；

S2，将所述生物基保护液与1g/100ml的CaCl2溶液按2:1的体积比例混合均匀，得到D型肉毒毒素保护液；

S3，将D型肉毒毒素徐徐加至所述D型肉毒毒素保护液中，得到毒素混合液，其中，D型肉毒毒素与D型肉毒毒素保护液的体积比例为1:3；然后向所述毒素混合液中加入食用色素胭脂红，其中毒素混合液与食用色素的比例为100ml:0.1g，得到D型肉毒毒素核液，4℃保存备用；其中，D型肉毒毒素的毒价为2000万MLD/ml；

S4，D型肉毒毒素仿生微囊颗粒的壳膜包被

将所述D型肉毒毒素核液注射入1g/100ml的海藻酸钠溶液中，然后加入无菌水，搅拌交联，过滤，清洗，过滤，然后将洗净的颗粒转入1g/100ml的CaCl2溶液中，搅拌钙化，得到海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒；具体操作如下：

S41，用无菌注射器吸取配制好的D型肉毒毒素核液，采用12号针头匀速滴加至配备好的30ml的1g/100ml的海藻酸钠溶液中，针头距离液面高度15cm，滴加后静置5s，先以40r/min搅拌交联10min，再以80r/min搅拌交联10min，得到交联溶液；

S42，在上述交联溶液中加入相当于交联溶液体积1/3的无菌水，以80r/min搅拌交联5min，过滤，收集交联的颗粒；

S43，将交联的颗粒收集到干净烧杯中，加入20mlpH7.0的Tris-Hcl溶液，清洗30s，过滤，收集洗净的颗粒；

S44，将洗净的颗粒转入至1g/100ml的CaCl2溶液中，以80r/min搅拌钙化20min，得到海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒，其外观形态如图1所示。

S5，精蛋白/氧化硅杂化壳壁的包被

将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，搅拌，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，搅拌，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒，具体操作为：

将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于配制好的30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，以80r/min的速度搅拌20min，使每个颗粒表面形成一层透明的囊膜，表面形成透明囊膜的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒外观如图2所示，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，以80r/min的速度搅拌10min，每个颗粒表面将包被形成精蛋白/氧化硅杂化壳壁，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒，外观如图3所示。

S6，外层包覆：为了增加D型肉毒毒素颗粒的可塑性以及可食性，我们选用麸皮(200目)、次粉、玉米粉按1:3:1的质量比例配制混匀后得到外层包裹物，将仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒置于其中，震荡混匀包裹，室温放置8-12h后装袋，密封，得到精制的D型肉毒毒素颗粒。

主要参考资料

[1] 王荫椿. (1998). 肉毒毒素及其临床应用. 卫生研究(s1), 10-14.

[2] 杨红华, & 高景恒. (2000). A-型肉毒毒素在面部除皱方面的应用. 中国美容整形外科杂志, 11(2), 89-93.

[3] 万新华. (1999). A型肉毒毒素治疗局限性肌张力障碍和肌肉痉挛. 引进国外医药技术与设备, 32(12), 10-13.