尿素卵黄双糖培养基的作用和应用研究

背景^[1-3]

尿素卵黄双糖培养基主要用于白喉杆菌的鉴别培养试验。用法：称取本品54.0g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装三角瓶,每瓶200ml,116℃高压灭菌20分钟,冷至50-55℃时,加入40%无菌尿素。

白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)是引起小儿白喉的病原菌，属于棒状杆菌属(Corynebacterium)。棒状杆菌种类较多，包括白喉杆菌和类白喉杆菌。类白喉杆菌为非致病菌，常见的有假白喉杆菌，结膜干燥杆菌、溃疡杆菌和痤疮杆菌等白喉杆菌菌体大小为（0.3~0.8μm）×（1~5μm），细长稍弯，粗细不一，菌体一端或两端排列呈棒状，排列不规则，常呈L、V、X、T等字形或排成栅栏状。革兰氏染色阳性，无荚膜、鞭毛，不产生芽胞；用美兰液染色菌体着色不均匀，常呈着色深的颗粒；用奈瑟氏染色菌体染成黄褐色，一端或二端染成蓝色或深蓝色颗粒，称为异染颗粒（Metachromatic granules），其主要成分是磷酸盐和核糖核酸，是本菌形态特征之一。白喉杆菌为需氧菌或兼性厌氧菌，最适温度为37℃，最适PH为7.2～7.8,在含血液、血清或鸡蛋的培养基上生长良好。菌落呈灰白色、光滑、圆形凸起，在含有0.033%亚碲酸钾血清培养基上生长繁殖能吸收碲盐，并还原为金属碲，使菌落呈黑色，为本属其他棒状杆菌共同特点。且亚碲酸钾能抑制标本中其他细菌的生长，故亚碲酸钾血琼脂平板可作为棒状选择培养基。根据在此培养基上白喉杆菌落的特点及生化反应，可将白喉杆菌区分为重型（Gravis）、中间型(Intermedus)和轻型(Mitis)三型，三型白喉杆菌的分布有所不同，常随地区和年份有别，有流行病学意义。

应用^[4][5]

用于白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白在白喉杆菌中表达及纯化体系的构建

结合疫苗的载体蛋白大多采用白喉毒素、破伤风类毒素、白喉无毒突变体CRM197蛋白,但由于白喉毒素、破伤风类毒素、均需要经甲醛脱毒处理得到,制备时需要对大量的毒素上清液进行处理,花费时间较长,而且脱毒后的类毒素存在毒性逆转的可能。CRM197蛋白是一种白喉毒素无毒突变体,不具有白喉毒素毒性,但具有良好的免疫原性和安全性,作为载体蛋白在国内外中应用广泛。本实验利用基因工程技术在白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae ATCC 27010)中对CRM197蛋白进行了表达,并对发酵,纯化工艺进行研究。在白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae ATCC 27010)中构建表达CRM197蛋白的重组质粒。在pK18mob-SacB载体上插入广谱复制起点,从而得到能够在白喉杆菌和大肠杆菌中穿梭复制的表达载体pCKM4.1;将完整的CRM197蛋白的表达基因插入此空载体pCKM4.1,得到游离于白喉杆菌染色体基因组外的稳定复制表达载体pCKM5.1,并通过接合转移的方法将其成功转化至白喉杆菌中以构建成基因工程菌株。表达产物经SDS-PAGE分析在58.0 kDa处可见清晰条带,Western blotting分析可见特异条带。对得到的基因工程菌株进行生产工艺摸索。通过接合转移转化至白喉杆菌(ATCC27010)中,载体上的导肽序列可以使得CRM197蛋白作为可溶性蛋白分泌到胞外表达,CRM197蛋白可占到菌体总蛋白的70%。同时加强对铁的调控,进一步优化培养基及发酵条件以提高产量。经过Q膜、硫酸铵沉淀、阴离子交换纯化步骤获得纯度达到95%的CRM197蛋白样品,大大的提高了蛋白得率,节约了纯化时间和成本。

参考文献

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[5]邓立功.白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白在白喉杆菌中表达及纯化体系的构建[D].天津科技大学,2014.