Western及IP细胞裂解液使用说明

Western及IP细胞裂解液概述^[1][2]

Western及IP细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。本细胞裂解液裂解的细胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。

Western及IP细胞裂解液的主要成分：20mM Tris (pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

Western及IP细胞裂解液使用说明^[1][2][3]

对于培养细胞样品：

1. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。

对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

3. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

对于组织样品：

1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

主要参考文献

[1] Zhang X, Chen S, Wang Y. Honokiol up-regulates prostacyclin synthease protein expression and inhibits endothelial cell apoptosis. Eur JPharmacol. 2007 Jan 5;554(1):1-7.

[2]. Cheng BQ, Geng Y, Wu JB, Jiang B. Influences of inhibiting Galectin-3 by RNA interference technique on the proliferation and apoptosis of human colorectal cancer cells LOVO. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research. 2007;Vol 11(16):3104-3107.

[3]. Dong X, Wang JN, Huang YZ, Guo LY, Kong X. Cell - penetra ting Peptide PEP - 1- med ia ted Tran sduction of Enhanced Green Fluorescen t Prote in in to Human Aortic SmoothMuscle Cells. J YMC.2007 Apr;26(2):71.