β-生育酚的应用和检测方法

背景及概述^[1-2]

β-生育酚是维生素E的一种。维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，即α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚。维生素E用作医药，对防止动脉硬化、贫血、肝病、癌症等均有良好的医用价值;作为动物饲料添加剂，可提高繁殖能力;在食品方面用作方便面、人造奶油、奶粉、油脂等的抗氧化剂，也可与维生素A、维生素A脂肪酸酯等配合使用。

应用^[1]

一种抗氧化剂组合物，包括如下组分：组分1：天然维生素E混合生育酚，组分2：α-生育酚；所述天然维生素E混合生育酚为含有α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的天然维生素E抗氧化剂；本发明天然维生素E复合抗氧化剂不仅具有良好的抗氧化效果，同时属于天然绿色抗氧化剂，对人体无毒无害。在室温下，α-生育酚抗氧化能力较强；而在高温条件下，γ-生育酚和δ-生育酚则具有更长的持续抗氧化能力，两者复配产生协效作用，能够显著提高食品级白油的抗氧化能力。

检测方法^[1]

维生素E主要为生育酚，包括α、β、γ、δ四种形式。脂溶性维生素包括视黄醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。一种同时检测5种脂溶性维生素的方法如下：

步骤一、溶液的配置与标定

(1)标准品的配制

取200μL浓度为5mg/mL的α-生育酚、20μL浓度为50mg/mL的β-生育酚、200μL浓度为1mg/mL的γ-生育酚、20μL浓度为50mg/mL的δ-生育酚和560μL浓度为0.1％的BHT色谱甲醇，混合均匀，得到1mg/mL维生素E标准品；

取50μL浓度为1mg/mL的视黄醇、500μL浓度为1mg/mL的维生素E标准品和450μL浓度为0.1％的BHT色谱甲醇，涡旋混合均匀，得到含有50μg/mL维生素A和500μg/mL维生素E的混合标准品。

-80℃避光条件下保存3个月，避免反复冻融。

(2)标准品的标定

吸取20μL含有50μg/mL维生素A和500μg/mL维生素E的混合标准品，置于5mL容量瓶中，用无水乙醇定容后，用紫外分光光度计标定标准品浓度，分别在视黄醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的紫外吸收波长下测定其紫外吸光值，根据公式(1)和(2)计算标准品的实际浓度，整个过程避光操作，其中，C为待标定的标准品的实际浓度，单位为g/100mL，A为紫外吸收波长下测定的标准品的吸光度平均值，E为待测样本的1％标准比吸光系数。

C＝A/E×稀释倍数(1)

稀释倍数＝10000×5mL/20μL(2)

(3)标准品的稀释

将标准品采用0.1％BHT甲醇溶液进行梯度稀释，得到浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL的标准品溶液。-80℃避光条件下保存3个月，避免反复冻融。

(4)内标工作液的配置

精确称取2mg五氘代视黄醇，置于10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至10mL，得到200μg/mL五氘代视黄醇溶液；精确称取2.5mg六氘代α-生育酚，置于5mL容量瓶中，用无水乙醇定容至5mL，得到500μg/mL六氘代α-生育酚溶液。标定方法与标准品的标定方法相同。

步骤二、样品预处理

将包含0.125μg/mL五氘代视黄醇和1.25μg/mL六氘代α-生育酚的内标工作液加入待测样品，纯水或甲酸水溶液稀释后，加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀高速离心去除蛋白质，加入正己烷萃取，涡旋混匀离心取上清液，将所述上清液常温氮气吹干，加入复溶溶液，涡旋混匀离心，得到的上清液即为预处理的样品。

步骤三、液相色谱-质谱联用分析

将7μL预处理的样品加入液相色谱-质谱联用仪的进样瓶中，色谱柱采用岛津C18柱，规格为5μm×2.1μm×50mm，色谱柱的温度为25℃，色谱柱采用梯度洗脱方式，梯度洗脱的流动相采用甲酸铵-乙腈混合液，流动相的流速为0.5mL/min，梯度洗脱的时间为6min，其中，梯度洗脱的条件如表1所示，具体为：第0-0.3min内，流动相恒定为50％甲酸铵和50％乙腈；第0.3-0.6min内，甲酸铵的体积百分比由50％连续减小至5％，乙腈的体积百分比由50％连续增大至95％；第0.6-1.8min内，流动相恒定为5％甲酸铵和95％乙腈；第1.8-2min内，甲酸铵的体积百分比由5％连续减小至2％，乙腈的体积百分比由95％连续增大至98％；第2-5min内，流动相恒定为2％甲酸铵和98％乙腈；第5-5.2min内，甲酸铵的体积百分比由2％连续增大至50％，乙腈的体积百分比由98％连续减小至50％；第5.2-6min内，流动相恒定为50％甲酸铵和50％乙腈。

步骤四、线性关系和定量限

对浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL的标准品溶液进行液相色谱-质谱联用分析，以色谱峰面积为纵坐标，以分析物的浓度为横坐标，绘制标准品曲线，线性权重取1/x，结果见表3。

表3五种分析物的线性回归方程及相关系数

 结果表明，视黄醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的浓度与其对应的色谱峰面积呈良好的线性关系，得到的线性范围和临床可报告范围相同：视黄醇的线性范围和临床可报告范围为0.05-5μg/mL，γ-生育酚的线性范围和临床可报告范围为0.1-10μg/mL，α-生育酚、β-生育酚和δ-生育酚的线性范围和临床可报告范围为0.5-50μg/mL。

步骤五、回收率和精密度

分别取维生素A和维生素E内标工作液，制备得到3种浓度的样品进行加样回收率和精密度实验。

主要参考资料

[1]CN201510777349.0抗氧化剂组合物及其应用

[2][中国发明]CN201810240542.4一种同时检测5种脂溶性维生素的方法及应用