如何制备赖氨酸加压素

背景及概述^[1][2]

赖氨酸加压素亦称“抗利尿激素”(antidiuretichormone，ADH)。一种9肽的激素，主要由下丘脑的视上核合成，然后送到垂体内储存起来。在机体需要时，释放入血液中。其主要的生理作用是增加肾小管对水的重新吸收，减少水分从尿中排泄(故称抗利尿激素)。当加压素缺乏或肾小管对加压素的反应性降低时，每天尿量剧增，可多至15升，称为尿崩症。患者大量排尿，极度口渴。在远超过生理剂量时，能使小动脉和毛细血管普遍收缩，外周阻力增加，血压上升。但在血压的生理性调节中作用不大。近年来发现加压素可以巩固大白鼠的防御性条件反射，使它不易形成消退性抑制。故认为加压素可能直接作用于中枢神经系统高级部位的神经元。

制备^[2]

赖氨酸加压素的合成

1)微波促进合成载有还原型催产素及血管加压素类多肽的树脂

树脂的溶胀：取Fmoc-RinkAmide-MBHAresin(取代量为0.5mmol/g)，将两批各1.2g(0.6mmol)Fmoc-RinkAmide-MBHAresin经25mLDCM溶胀30min，抽去DCM，再用25mLNMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP10mL冲洗干净.微波促进脱除Fmoc保护基：将上述溶胀好的树脂放入反应器中，加入10mL含0.1mol•L－1HOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在45℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入10mL含0.1mol•L－1HOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在45℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却.反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净.得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂.微波促进Fmoc-Gly-RinkAmide-MBHAresin的合成：将Fmoc-Gly-OH(3.0mmol)，HBTU(3.0mmol)，HOBT(3.0mmol)和DIPEA(6.0mmol)溶于15mLNMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应5min，微波功率为25W，反应温度控制在45℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却.反应结束后滤掉反应液，用DCM和NMP各10mL洗涤树脂3次.

肽链的延长：按照催产素和赖氨酸加压素各自的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合微波促进反应时间5～20min不等.接完最后一个氨基酸后Fmoc保护基暂时不用脱除，各自得到连有还原型催产素和还原型赖氨酸加压素两种不同多肽的树脂.

2）微波辅助I2氧化法固相形成二硫键

将上述得到的两种不同的N端Fmoc未脱除的还原型树脂各0.2mmol放入反应器中，加入10mL溶有0.15gI2的苯甲醚/NMP(V/V＝1/50)溶液中，在微波反应器中反应10min，微波功率为10W，反应温度控制在45℃以内，使用空气压缩机压缩空气，气流冷却.反应结束后滤除反应液，分别用四氯化碳，DMF，DCM将树脂洗涤干净，再按照上面脱除Fmoc保护基的方法脱去N端最后一个残基连接的Fmoc保护基.

3）常温下I2氧化法固相形成二硫键

将上述得到的两种不同的N端Fmoc未脱除还原型树脂各0.2mmol放入反应器中，各加入10mL溶有0.15gI2的苯甲醚/NMP(1∶50，V/V)溶液中，在常温下反应2h.反应结束后滤除反应液，分别用四氯化碳，DMF，DCM将树脂洗涤干净，再按照上面脱除Fmoc保护基的方法脱去N端最后一个残基连接的Fmoc保护基.

4）树脂上多肽的裂解

将上述得到的两种载有不同还原型多肽的树脂、在微波促进条件下和常温下条件氧化得到两种载有不同环肽的树脂各0.2mmol放入反应瓶中，各加入裂解剂RegeantK[V(TFA)∶V(苯甲硫醚)∶V(水)∶V(苯酚)∶V(EDT)＝82.5∶5∶5∶5∶2.5]10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应1h.反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤3次，合并滤液.将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到相应的粗品.

4）粗品的分析纯化

粗将最后得到的还原型和氧化型多肽粗品溶于少量的水中，用岛津制备型反相HPLC纯化粗品.纯化中采用C18反相制备柱(340mm×28mm)；流动相A：0.1%TFA/水(V/V)，流动相B：0.1%TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B20%～65%，40min；流速为5mL•min－1；检测波长为214nm.收集的溶液冻干得还原型和氧化型多肽的纯品.粗品的HPLC分析取少量不同固相环合条件下得到的氧化型多肽粗品，溶于乙腈/水中，用岛津2010C型HPLC梯度洗脱分析.采用C18反相柱(150mm×4.6mm)；流动相A：0.1%TFA/水(V/V)，流动相B：0.1%TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B10%～50%，20min；流速为1mL•min－1；柱温为40；℃检测波长为214nm.

作用与用途^[3]

本品为合成加压素，其作用同垂体后叶吸入剂。维持时间约4小时，对鼻黏膜刺激较少，对严重的尿崩症病人疗效不明显。用于轻、中型尿崩症的治疗。

用量与用法^[3]

为喷雾剂：每次向鼻腔内喷1～2下，每日3～5次。

不良反应与注意事项^[3]

本品作用时间短，对严重病人疗效较差。

剂型^[3]

喷雾剂：5mL(每毫升含50加压单位)。

主要参考资料

[1] 心理咨询大百科全书

[2] 微波促进催产素和赖氨酸加压素环肽的固相合成

[3] 最新全科医师用药手册