水蛭多肽的应用

概述^[1-2]

水蛭(学名)又名蚂蟥，是一种生长于沼泽、湖泊或水田中的环节动物，以吸食人畜的血液为生。水蛭是较强的活血化瘀药物，据《神农本草经》记载：“水蛭味咸平，主逐恶血，月闭，破血瘕集聚，无子，利水道。”有研究从中药干药材日本医蛭(hirudo)中分离纯化出相对分子质量(Mr)为500～1000的水蛭多肽，并采用大鼠大脑中动脉栓塞性脑缺血再灌注损伤模型，观察水蛭提取物对局灶性脑缺血大鼠脑梗死面积、脑组织含水量改变、脑组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)含量等的影响，探讨其抗脑缺血损伤的作用机制，为进一步研究提供实验依据。

应用^[2-3]

水蛭及含有水蛭的中成药或复方制剂如水蛭多肽已广泛应用于冠心病、心绞痛、急性心肌梗塞、缺血性脑中风(如脑血栓、脑梗塞及其后遗症)、高血压、高血脂、脑动脉粥样硬化等疾病、动脉粥硬化及周围血管病等疾病的防治。近年来关于水蛭防治心脑血管疾病的基础研究不断深入。其应用举例如下：

1)水蛭多肽对局灶大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用。线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。缺血再灌注损伤后24h，进行神经功能评分，测定脑含水量、缺血面积、脑、组织匀浆超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量。结果水蛭多肽能显著降低组脑组织含水量，缩小脑梗死面积，提高超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量。水蛭多肽对于大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其作用机制可能与抑制脂质过氧化、提高抗氧化酶活性有关。

2）制备一种水蛭多肽注射制剂，其特征在于水蛭多肽提取过程采用水为溶剂，纯化过程单独使用两组效果的阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱和阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱。纯化后加或不加药用辅料，制备成水蛭多肽注射制剂；其特征还在于提取过程不使用任何有机试剂；该制备方法简单，操作过程无环境污染，省时节源并且使水蛭多肽的纯度大大提高，同时抗凝血活性得到了显著的提高，采用该纯化方法得到的水蛭多肽的凝血酶比活为1∶32。

制备^[3]

一种水蛭多肽的分离纯化方法：

步骤1：水蛭提取物的提取

取水蛭干燥全体1kg粉碎成60目粉末，加入10kg蒸馏水水，匀浆；取匀浆液，调节pH至8.5，按每1g水蛭干药材加入10000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度50℃，酶解6h，冷却至室温；酶解完后，向上述酶解液中加入4倍体积的乙醇冷藏沉淀8h，过滤，滤液减压干燥，得水蛭提取物100g。

步骤吧2：水蛭多肽的分离纯化

人结直肠腺癌Caco-2细被接种到transwell小室中，采用DMEM培养基，含有20％FBS，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，2mmol/LL-谷氨酰胺，培养条件为5％CO2，37℃，接种密度为45万个细胞/孔，每周换液3次，连续培养两周。Caco-2细胞层的完整性通过细胞电阻仪检测TEER值而确定，TEER值大于500Ω/cm2可用于实验研究。步骤1中提取的水蛭提取物被溶解在PBS(pH值7.2)缓冲液中，配制成浓度为1mg/mL的水蛭提取物溶液。实验开始前，将transwell小室中去除培养基，用PBS清洗培养小室两次。

每个上室内加入0.3mL水蛭提取物溶液，下室加入1.2mLPBS缓冲液。作用2h以后，将下室中PBS溶液全部收集起来，备用。上述下室溶液经QSephrose阴离子交换柱层析，2mol/LNaCl溶液线性洗脱，收集各个峰的活性成分，经血管平滑肌细胞迁移筛选，取活性最高的一个峰的活性成分，本实验中得到四个峰，第三个峰的活性最高(详见附图2，左起第三个)，收集此处的活性组分，浓缩并干燥；将上述的第三个峰组分用蒸馏水溶解，经LH-20凝胶过滤层析，蒸馏水洗脱，收集各个峰的活性成分，经血管平滑肌细胞迁移筛选，取活性最高的一个峰的活性成分，本实验中得到两个峰，取个峰，收集此处的活性组分，浓缩并干燥，即得水蛭多肽。

主要参考资料

[1] CN200510080314.8一种水蛭多肽冻干粉针制剂及其制备方法

[2] 水蛭多肽对局灶大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用

[3] CN201610040895.0一种水蛭多肽的分离纯化方法