乙醇脱氢酶的制备

背景^[1]

乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）是一种含锌酶类，在机体内分布有较高器官特异性，在肝脏内最为丰富。在正常机体生理代谢中，ADH能够催化乙醇（酒精）代谢。在临床上，血液中ADH的含量是诊断肝脏疾患的指标之一，在正常情况下，ADH在肝脏中含量最高，血清中的ADH是恒定的。当在肝脏受损时，如急性中毒性肝损伤、酒精肝病、慢性活动肝炎等，ADH由细胞内释放到血清中，从而引起ADH在血清中升高。

目前在人体内发现了7种亚型，分别为ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH4、ADH5、ADH6和ADH7

结构^[2]

ADH1B晶体结构

制备^[2]

目前人源的ADH的获取主要通过原核表达方式生产，主要是通过肝脏中提取mRNA，经RT-PCR扩增目的基因，构建至表达载体，转化至表达感受态，获量表达ADH蛋白的大肠杆菌，以M9培养基对大肠杆菌大量培养，诱导表达，大量制备出ADH蛋白，经相应的纯化工艺，获得纯品ADH。此生产方式成本低，需要的设备相对较少，其中最常用和重要的是大肠杆菌培养基，它是影响ADH的产量关键因素之一，目前市面常用的是M9，配制简单，且原材料易于获取。

人血清中乙醇脱氢酶检测

目前监测人血清中ADH含量的常用方法是双抗夹心酶联免疫分析（ELISA）。该方法是敏感性高，特异性强，操作简易，且结果易于观察。其主要原料是ADH和两个ADH抗体，分别用于包被和标记酶。首先将ADH抗体包被到ELISA板中，制成固相抗体，在微孔中加入不同浓度的ADH标品进行反应，经过洗涤去除非特异性结合，再加入酶标记的抗体，进行反应，形成ADH抗体—ADH—酶标记的ADH抗体的复合物，经过彻底洗涤后，加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显色反应，显色强弱与ADH的含量呈正比，在酶标仪中读取OD450/ OD600值。以OD450/ OD600值纵坐标（y轴），以ADH不同的浓度为横坐标（x轴），建立标准曲线和方程。将待测血清加入ELISA试剂盒 中进行检测，根据其OD值，代入方程，计算出相应含量。

在试剂盒建立过程， 除主要原料影响之外，其中影响的就是稀释液。如抗体稀释液、ADH稀释液，都会影响到试剂盒的特异性和稳定性，目前，在稀释液中都会添加一种或多种成份如BSA、酪蛋白、鸡标准血清、牛血清、马血清等等，来提高试剂盒的抗干扰能力和稳定性。

主要参考文献

[1] 卢现英.ADH检测的临床新研究[J].中外医疗.2011.01(c):0192

[2] Niederhut, M.S., Gibbons, B.J., Perez-Miller, S., Hurley, T.D. Three‐dimensional structures of the three human class I alcohol dehydrogenases [J].Protein Science.2001,10(4):697-706