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分选磁珠的应用

发布日期:2020/1/8 10:57:42

背景[1-6]

分选磁珠是基于SPRI(SolidPhaseReverseImmobilization)原理,配合精心优化过的缓冲体系,可用于二代测序文库构建过程中的DNA片段分选、纯化。可适用于各品牌的DNA、RNA建库试剂盒。分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等,在一定浓度的PEG和盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程是可逆的,在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。

纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面是羧基(-COOH)修饰的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。在整个体系中,PEG是影响DNA回收的决定性因素(其他因素还包括DNA大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。

DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,使DNA发生脱水反应,分子构象会发生急剧变化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用,改变不同长度DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。当处于PEG和盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。

但普遍认为,这是由于带正电荷的盐离子的作用(如Na+)。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后,加入水性分子,会快速充分水化DNA,解除其三者之间的离子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。磁珠的出现,使得核酸制备的实验可以实现自动化,同时相较于传统的回收方式,还具有3个明显的优势:1)效率更高,以DNA为例,1μL磁珠的承载量可达7μg;2)避免使用有机溶剂,如酚类、氯仿等等,更加安全;3)操作简单,无需离心,也更有利于保留核酸的完整性。

应用[7][8]

用于重组酶介导的等温扩增技术在转基因检测中的应用

重组酶等温扩增技术(recombinase ploymerase amplification,RPA)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理,模拟体内DNA复制的酶反应过程,对DNA模板进行扩增,可在39℃左右的恒温条件下,20分钟内完成扩增反应。结合DNA快速提取技术,可使转基因作物在野外快速检测中具有广泛的应用前景。

结果如下:

1.RPA等温扩增技术用于转基因检测研究:本研究选取了几种转基因检测中的常用靶标原件,如CaMV35S启动子、nos终止子、HPT基因以及Bt基因等,建立了RPA的凝胶和荧光快速检测方法。结果证实,基于探针检测的荧光RPA方法具有较高的灵敏度,可以稳定检测到100个分子拷贝数。同时荧光RPA方法适用性强,可以用于不同转基因作物的成分检测。15-25分钟内便可以得到稳定、可靠的检测结果。

2.磁珠快速提取植物DNA方法的建立:本研究利用三种便携式DNA提取装置,通过对提取条件的优化,开发出植物总DNA快速粗提取方法。该方法可以在室温条件下,20分钟内完成不同植物DNA的提取。结果证实磁珠法快速提取植物基因组DNA可以用于PCR检测,同时还可以对0.1%的转基因玉米MON810进行品系特异性检测。后续研究进一步结合RPA荧光检测技术,成功的对转基因水稻TT51-1进行了nos终止子和Bt基因成分检测,建立了适用于野外检测的转基因作物快速精准检测方法。

参考文献

[1] Liu,Lingling,et al.'Size-selective separation of DNA fragments by using lysine-functionalized silica particles.'Scientific reports 6(2016):22029.

[2] He,Z.Y.,Xu,H.,Xiong,M.&Gu,H.Size-selective DNA Separation:Recovery Spectra Help Determine The Sodium Chloride(NaCl)and Polyethylene Glycol(PEG)Concentrations Required.J.Biotechnol.9(2014),1241–1249.

[3] He,Z.,Zhu,Y.&Gu,H.A New Method for The Determination of Critical Polyethylene Glycol Concentration for Selective Precipitation of DNA Fragments.Appl.Microbiol.Biotechnol.97(2013),9175–9183.

[4] Froehlich,E.,et al.'PEG and mPEG–anthracene induce DNA condensation and particle formation.'The Journal of Physical Chemistry B 115.32(2011):9873-9879.

[5] Hong-yang Yu.The Mechanism Study of Plasmid DNA abstraction based on SPRI.Biological Science,2003.

[6] Sinclair B.To bead or not to bead:Applications of magnetic bead technology.Scientist,13(1998):16.

[7] Lis JT.Fractionation of DNA fragments by polyethylene glycol induced precipitation.Meth Enzymol 65(1980):347–353.、

[8] 徐潮.重组酶介导的等温扩增技术在转基因检测中的应用[D].中国农业科学院,2014.

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