分选磁珠的应用

背景^[1-6]

分选磁珠是基于SPRI(SolidPhaseReverseImmobilization)原理，配合精心优化过的缓冲体系，可用于二代测序文库构建过程中的DNA片段分选、纯化。可适用于各品牌的DNA、RNA建库试剂盒。分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定（SPRI）的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面（即固相载体），该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。

纳米级别的磁珠表面性质不同，分离原理也不尽相同，但基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层，最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁（Fe3O4），最外层表面是羧基（-COOH）修饰的高分子材料所构成，其中羧基行使与核酸结合的工作。在整个体系中，PEG是影响DNA回收的决定性因素（其他因素还包括DNA大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等）。

DNA在一定浓度的PEG存在条件下，NaCl或MgCl₂促进条件下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中，特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用，改变不同长度DNA的分子构象，同时增加体系的粘稠程度，使磁珠存在其中处于悬浮状态，不易沉降，增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥，从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果，除此之外，PEG与蛋白质具有相容性，也可去除样品中的蛋白质。当处于PEG和盐离子环境中的DNA，因脱水作用而发生分子构象改变后，会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的羧基磁珠结合，但如何解释负负电荷之间的作用，目前还不得而知。

但普遍认为，这是由于带正电荷的盐离子的作用（如Na⁺）。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子（如Na⁺）与羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化DNA，解除其三者之间的离子相互作用，使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。磁珠的出现，使得核酸制备的实验可以实现自动化，同时相较于传统的回收方式，还具有3个明显的优势：1）效率更高，以DNA为例，1μL磁珠的承载量可达7μg；2）避免使用有机溶剂，如酚类、氯仿等等，更加安全；3）操作简单，无需离心，也更有利于保留核酸的完整性。

应用^[7][8]

用于重组酶介导的等温扩增技术在转基因检测中的应用

重组酶等温扩增技术（recombinase ploymerase amplification,RPA）是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，对DNA模板进行扩增，可在39℃左右的恒温条件下，20分钟内完成扩增反应。结合DNA快速提取技术，可使转基因作物在野外快速检测中具有广泛的应用前景。

结果如下：

1.RPA等温扩增技术用于转基因检测研究：本研究选取了几种转基因检测中的常用靶标原件，如CaMV35S启动子、nos终止子、HPT基因以及Bt基因等，建立了RPA的凝胶和荧光快速检测方法。结果证实，基于探针检测的荧光RPA方法具有较高的灵敏度，可以稳定检测到100个分子拷贝数。同时荧光RPA方法适用性强，可以用于不同转基因作物的成分检测。15-25分钟内便可以得到稳定、可靠的检测结果。

2.磁珠快速提取植物DNA方法的建立：本研究利用三种便携式DNA提取装置，通过对提取条件的优化，开发出植物总DNA快速粗提取方法。该方法可以在室温条件下，20分钟内完成不同植物DNA的提取。结果证实磁珠法快速提取植物基因组DNA可以用于PCR检测，同时还可以对0.1%的转基因玉米MON810进行品系特异性检测。后续研究进一步结合RPA荧光检测技术，成功的对转基因水稻TT51-1进行了nos终止子和Bt基因成分检测，建立了适用于野外检测的转基因作物快速精准检测方法。

参考文献

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[4] Froehlich,E.,et al.'PEG and mPEG–anthracene induce DNA condensation and particle formation.'The Journal of Physical Chemistry B 115.32(2011):9873-9879.

[5] Hong-yang Yu.The Mechanism Study of Plasmid DNA abstraction based on SPRI.Biological Science，2003.

[6] Sinclair B.To bead or not to bead:Applications of magnetic bead technology.Scientist,13(1998):16.

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[8] 徐潮.重组酶介导的等温扩增技术在转基因检测中的应用[D].中国农业科学院,2014.