IPSCS标志物检测的应用

背景^[1-6]

IPSCS标志物检测是通过对IPSCS标志物的进行生物检测以鉴定IPSCS的分化程度及功能的一种手段。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）是把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,PSCs)技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。分化的细胞在特定条件下被逆转后,恢复到全能性状态,或者形成胚胎干细胞系,或者进一步发育成新个体的过程即为细胞重编程(Cell reprogramming)。

分化是基因选择性表达的结果,并没有改变遗传物质,而重编程在某种意义上就是分化的一个逆转。与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同,PSCs技术不使用胚胎细胞或卵细胞,因此没有伦理学问题。此外,利用IPSCS技术可以用病人自己的体细胞制备专有的干细胞,从而大大降低了免疫排斥反应发生的可能性。iPSCS的岀现,在干细胞、表观遗传学以及生物医学等研究领域都引起了强烈的反响,使人们对多能性的调控机制有了突破性的新认识,进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。

iPSCS在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选以及神经系统疾病、心血管疾病等临床疾病治疗等方面具有巨大的潜在价值。IPSCS标志物是在IPSCS分化完成后才能生产的特异性物质包含RNA、蛋白及其他物质。通过检测这些特异性物质就可以了解到细胞的分化程度这对后续的实验有着指导性的作用。

应用^[7][8]

用于白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究

白内障摘除联合人工晶状体(intraocular lens,IOL)植入是目前治疗白内障最常用且效果较为理想的方法,而后囊膜混浊(posterior capsular opacification,PCO)是影响病人术后远期视力预后的最常见的并发症,其术后5年的发生率高达30%左右。

体细胞诱导成为多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。方法正常人晶体上皮细胞培养取材于角膜移植术后供体眼的晶状体囊膜,年龄相关性白内障晶体上皮细胞培养取材于白内障超乳手术中撕除的晶体前囊膜。取年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成1mm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经多次传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。在倒置相差显微镜下对三种细胞进行形态学观察。采用CCK-8法连续7天测定三种细胞的增殖速率,绘制生长曲线并进行比较。结果正常人晶体囊膜组织块贴壁48～72小时后可见人晶状体上皮细胞从组织块边缘长出,约10～15天达到融合。初期正常人晶体上皮细胞为多角形,胞体透亮,细胞边界清晰。融合后的细胞具有上皮细胞的形态特征,为典型的六角形或多边形。

分别构建表达OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体(Lentivirus),并转染年龄相关性白内障患者体外培养的晶体上皮细胞,诱导建立患者来源的诱导性多能干细胞,与同一患者来源的皮肤成纤维细胞对比,观察限定因子对于诱导多能干细胞的诱导效率。分别将含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体质粒(plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4)同辅助质粒(pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg)一起共感染293T细胞,重组包装构建慢病毒载体(分别为Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4).将构建的三种慢病毒载体混合分别感染第2代的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,培养5天后,与小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)进行共培养,直至出现iPSCs。

对诱导建立的白内障患者来源的诱导性多能干细胞(iPSCs)进行鉴定,检测细胞的分子标记及体内外分化能力,评价其多能性。方法对已成功诱导的白内障患者来源的iPSCs进行多能性鉴定：基因表达、免疫荧光染色分析、RT-PCR检测、体外分化拟胚体、体内分化畸胎瘤检测。提取iPSCs、ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA采用HG-U133-2array(Affymetrix)对三种细胞的全基因表达谱进行检测并进行对比。

参考文献

[1]Differential effects of planktonic and biofilm MRSA on human fibroblasts[J].Garth A.James,John E.Olerud.Wound Repair Regen.2012(2)

[2]Prospect of Induced Pluripotent Stem Cell Genetic Repair to Cure Genetic Diseases[J].Jeanne Adiwinata Pawitan,Rajarshi Pal.Stem Cells International.2012

[3]Potential rescue,survival and differentiation of cancer stem cells and primary non-transformed stem cells by monocyte-induced split anergy in natural killer cells[J].Anahid Jewett,Han-Ching Tseng.Cancer Immunology,Immunotherapy.2012(2)

[4]Noggin[J].Carola Krause,Asja Guzman,Petra Knaus.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2011(4)

[5]Reconstitution of the Mouse Germ Cell Specification Pathway in Culture by Pluripotent Stem Cells[J].Katsuhiko Hayashi,Hiroshi Ohta,Kazuki Kurimoto,Shinya Aramaki,Mitinori Saitou.Cell.2011(4)

[6]The lens:a classical model of embryonic induction providing new insights into cell determination in early development[J].Lena Gunhaga.Philosophical Transactions of the Royal Society B.2011(1568)

[7]Bone morphogenetic protein 7(BMP7)mutations are associated with variable ocular,brain,ear,palate,and skeletal anomalies[J].Alexander W.Wyatt,Robert J.Osborne,HelenStewart,Nicola K.Ragge.Hum.Mutat..2010(7)

[8]邱晓頔.白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究[D].复旦大学,2012.