硝基还原酶的相关研究

背景及概述^[1-2]

硝基还原酶是一类以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或尼克酰胺二核苷酸为氢供体的黄素蛋白。近年来，因硝基还原酶参与了爆炸物、硝基化合物类环境污染物的降解，而逐渐走进人们的视野。随着基因治疗新技术的发展，L.M.CoBB（1969）合成出CB1954，人们开始挖掘硝基还原酶/CB1954在基因治疗中的应用前景。硝基还原酶存在于哺乳动物的心脏、肝、肾、肺、脑组织中它可在厌氧条件下，由NADPH和NADH提供氢催化硝基芳香族化合物还原。

活性检测^[3]

硝基还原酶可由大肠杆菌等细菌合成，在人的某些类型的细胞处于缺氧状态时也会大量表 达,在还原型辅酶Ⅰ(NADH)或Ⅱ(NADPH)存在下，硝基还原酶可以代谢芳香族硝基化合物；另 一方面，硝基还原酶可用于生物化工合成、抗肿瘤药物研发等领域(万琼琼等，分析科学学报， 2014年，第30卷，755-759页)。因此，评价硝基还原酶的活性就有着十分重要的意义。荧光法是有效检测硝基还原酶活性的手段之一。

CN201610200607.3提供了一种可用于选择性检测硝基还原酶的荧光探针，在生理 条件下硫化氢不能使得体系荧光增强。本发明采用如下技术方案：采用萘酰亚胺染料作为荧光母体，基于硝基被还原为氨基引起 的多米诺分解反应，在还原型辅酶Ⅰ存在下，本探针可以在pH为7.2的水溶液中选择性地被硝 基还原酶代谢，代谢产物可以发出强荧光，从而实现选择性地检测硝基还原酶。

所述荧光探针的结构式为A：

上述结构式A表示的荧光探针应用于检测硝基还原酶，反应生成具有结构式B结构的化合物，从而导致体系荧光增强。

结构式A所示的荧光探针可对硝基还原酶定性、定量的检测。将浓度呈梯度变化的硝基还 原酶分别加入含荧光探针A和还原性辅酶Ⅰ的水溶液中，反应达到平衡后，分别测定各样品的荧 光强度，然后以硝基还原酶的浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，即可根据荧 光强度从图中读出待测溶液中硝基还原酶的含量。

本发明的有益效果：在硝基还原酶、还原性辅酶Ⅰ的存在下，荧光探针A的水溶液的荧光发生显著改变，可用于高选择性、高灵敏性地检测硝基还原酶含量或活性。

相关研究^[4-5]

滕隔玲等人体外观察了大肠杆菌硝基还原酶/[5-(1-氮丙啶)-2,4-二硝基苯甲酰胺](以下简称NTR/CB1954)自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞的杀伤效应,探索一种新的宫颈癌基因治疗方法。方法:利用PCR技术从Escherichia coli K12的基因组中扩增出编码NTR的基因nfsB,酶切后,连接到真核表达载体pcDNA3上,获得重组载体pcDNA3-nfsB,lipofectamineTM2000脂质体转染法将pcDNA3-nfsB转染Hela细胞,筛选稳定表达细胞株,应用RT-PCR以及SDS-PAGE检测NTR在Hela细胞中的表达,MTT法检测NTR/CB1954对Hela细胞活力的影响,流式细胞术检测亚二倍体细胞率改变,PI/Hoechest33258双染荧光显微镜下观察Hela细胞凋亡率。

结果:成功构建了真核表达载体pcDNA3-nfsB,获得稳定表达NTR的Hela细胞株,在mRNA水平以及蛋白水平检测到NTR在Hela细胞中的表达,NTR/CB1954自杀基因系统明显影响Hela细胞的活力,增加了Hela细胞的凋亡率。结论:NTR/CB1954自杀基因系统对Hela细胞在体外通过凋亡产生明显的杀伤效应。

阮陈孝辉开发了一种利用硝基还原酶(Nitroreductase)催化还原硝基化合物合成羟胺的方法,该方法具有高选择性、可控性、反应条件温和、不需要严格控制反应时间和催化剂量等优点。本研究首先采用基因挖掘的方法,从庞大的基因库中筛选获得了一种来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的硝基还原酶(BaNTR1),通过亲和镍柱层析对其进行纯化,并对纯化后的蛋白进行了酶学性质研究。

结果表明：该酶的最适温度为35℃,最适pH值为7.0；该酶在40℃,50℃和60℃的半衰期分别为65h,18h和0.39h；金属离子Cu²⁺和Ag⁺对该酶有强烈的抑制作用。在巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶BmGDH作为催化剂用于辅酶循环再生的10mL反应体系中,添加0.3NADP⁺和10mg BaNTR1冻干酶粉,1h内100mM的对硝基苯甲腈被完全转化,产物羟胺的化学选择性>99%。值得注意的是,随着反应时间的延长,羟胺并未被进一步还原成胺或形成其他副产物,其选择性依然>99%。

底物谱研究表明：BaNTR1对带有吸电子基团(氰基、羧基、羰基、酰胺基、硝基)的芳香硝基底物具有很好的活性和选择性,而对带有供电子基团的芳香硝基化合物,虽然也能被转化(96.7%转化率),但形成的产物中并未检测到芳香羟胺,这表明该方法较适合于带有吸电子基团的芳香羟胺合成。利用10g/L共表达的冻干细胞作为催化剂,在不额外添加辅酶的情况下,100mM的对硝基苯甲腈在1h内转化率为100%,选择性>99%。为了提高反应中底物的上载量, 阮陈孝辉对两相反应体系进行了研究。结果显示：在甲苯/水两相反应体系(v/v,1/1)中,底物的上载量从100mM提高至300mM,300mM的对硝基苯甲腈在2.5h内即被完全转化,选择性仍保持在99%以上。综上所述,本研究为芳香羟胺建立了一个高选择性可控的酶促合成方法。

主要参考资料

[1]卫生学大辞典

[2] [中国发明,中国发明授权] CN201310627211.3 一种硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用

[3] [中国发明] CN201610200607.3 一种检测硝基还原酶的荧光探针及其应用

[4]滕隔玲,杨业鹏,李载权,周梅,李五岭.硝基还原酶/CB1954自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞杀伤效应的实验研究[J].现代肿瘤医学,2009,17(08):1403-1406.

[5]阮陈孝辉（Nguyen Tran Hieu Huy）. 硝基还原酶的资源挖掘及其在芳香羟胺可控合成中的应用研究[D].华东理工大学,2014.