胱抑素C的检测方法

概述^[1]

胱抑素C(Cystatin C或简称Cys C)是半肤氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员之一。 它的分子量为13kD，是由122个氨基酸组成的低分子量非糖基化蛋白质，且能在所有有核细胞中恒定、持续地转录及表达，可被看做House keeping基因。胱抑素C是一种小分子血浆蛋白质，为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，人体的有核细胞都能稳定地产生。胱抑素C可被肾小球 自由滤过，其浓度与肾小球滤过率呈负相关，不受性别、年龄、饮食、炎症、血脂、肝脏疾 病等因素的干扰，可以较准确的反映肾功能损伤。因此胱抑素C是一种理想的反映肾小球滤过率(GFR)变化的内源性标志物。目前国内外都把胱抑素C作为公认的肾功能检测指标。鉴 于当前全球慢性肾脏病发病率不断上升，胱抑素C作为临床检查的诊断价值日益引起人们的重视。

检测方法^[2]

一种胱抑素C检测试剂盒的制备方法包括试剂R1的制备方法、试剂R2的制备方法和胱抑素C校准品的制备方法。

试剂R1的制备方法如下：

称取800mL 50mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH6.1-6.7)，然后加入15mL的吐温-20、 0.25g PEG-20000和0.9g叠氮钠，定容至1L，混匀，得试剂R1。

试剂R2的制备方法如下：

(1)稀释抗体，用40mL 50mmol/L的MES缓冲液(pH8.1-8.5)稀释兔抗人胱抑素C多克隆抗体至1mg/mL，得兔抗人胱抑素C多克隆抗体稀释溶液；

(2)用4.5mL 50mmol/L的MES缓冲液溶解36mg EDC，得到8mg/mL活化剂溶液；

(3)胶乳微球活化，在20g粒径为100nm的聚苯乙烯胶乳微球中加入4.5mL活化剂溶液，25℃搅拌反应30min，得活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液；

(4)抗体与胶乳微球偶联：在步骤(3)活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液中缓慢滴加步 骤(1)中的所有的兔抗人胱抑素C多克隆抗体稀释溶液，得到胱抑素C抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.002:1，25℃搅拌反应3h即得偶联兔抗人胱抑素C多克隆抗体的聚苯乙烯胶 乳微球悬浊液；

(5)悬浊液封闭：在步骤(4)的偶联兔抗人胱抑素C多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微 球悬浊液中加入55g蔗糖后25℃封闭30min；

(6)悬浊液封闭完成后加入含有4mL吐温-20、0.9g叠氮钠、0.45g PEG20000的 50mmol/L硼酸盐缓冲液至终体积为1L，混匀后即得试剂R2。

胱抑素C校准品的制备方法如下：

将纯化好的胱抑素C蛋白用含有9g/L氯化钠、1g/L叠氮钠的100mmol/L磷酸盐缓冲液进行稀释，使胱抑素C蛋白的浓度分别控制在0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L，得到 胱抑素C校准品，所述胱抑素C校准品均为无色透明液体。

使用胱抑素C检测试剂盒检测待测血清中胱抑素C含量的步骤：

(1)取200μL试剂R1与5μL待测血清样本混匀；

(2)将混匀后的溶液在37℃孵育5min；

(3)再加入50μL试剂R2，立即测定读取待测血清样本的吸光度A1和胱抑素C校准品 的吸光度，5min后测定读取待测血清样本的吸光度A2和胱抑素C校准品的吸光度，利用吸光 度计算待测血清样本中胱抑素C的含量。

作用研究^[3]

刘宋芳等人探讨了胱抑素C（CysC）在尿清蛋白阴性的2型糖尿病（T2DM）患者中对早期肾损伤的诊断价值。方法：纳入该院514例24h尿清蛋白正常的T2DM患者,其中231例肾小球滤过率（eGFR）≥90mL·min^-1·1.73m^-2（eGFR正常组）,283例eGFR<90mL·min^-1·1.73m^-2（eGFR下降组）。测量所有受试者的身高、体质量,计算体质量指数,检测并比较两组的糖化血红蛋白、总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、CysC、肌酐、尿素氮、尿酸及24h尿清蛋白水平。

结果：514例24h尿清蛋白正常的T2DM患者,有55.1%的患者eGFR<90mL·min^-1·1.73m^-2,有3.5%的患者eGFR<60mL·min^-1·1.73m^-2。与eGFR正常组比较,eGFR下降组CysC明显升高（P<0.05）,而两组24h尿清蛋白定量水平差异无统计学意义（P>0.05）。eGFR与CysC呈负相关（r=-0.316,P<0.05）,与24h尿清蛋白无相关性（r=0.052,P=0.246）。以eGFR<90 mL·min^-1·1.73 m^-2为肾功能异常标准,24h尿清蛋白曲线下面积（0.483）明显小于CysC的曲线下面积（0.710）。CysC的诊断分界点为0.905mg/L。

结论：糖尿病肾病的早期损伤不仅表现为尿微量清蛋白的升高,还存在一部分尿蛋白阴性的T2DM的存在。CysC对于尿清蛋白阴性的T2DM患者的早期肾损伤具有更好的评估和诊断价值。

主要参考资料

[1] [中国发明] CN201210104241.1 一种在酵母中制备重组胱抑素C的方法

[2] [中国发明] CN201711386334.7 一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法

[3] 刘宋芳,王述进,杨华,牛瑜,马磊,齐婷,张艺,林红.胱抑素C在尿清蛋白阴性的2型糖尿病患者中对早期肾病的诊断价值[J].检验医学与临床,2019,16(17):2500-2503.