细胞膜红色荧光染料 DID

1. 染色液制备
（1）配置DMSO或EtOH储存液：储存液用 DMSO或EtOH配置浓度1～5 mM。注：a、未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融，可稳定保存6个月。b、发现较难溶解时可以适当加热，并用超声处理以促进溶解。
（2）工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，配制浓度为1～5 μM的工作液。注：工作液最终浓度建议根据不同细胞系和实验体系来优化

2. 悬浮细胞染色
（1）加入适当体积的染色工作液重悬细胞，使其密度为1×106/mL。
（2）37℃孵育细胞 2～20 min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20 min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
（3）孵育结束，按1000～1500 rpm离心5 min。
（4）倾倒上清液，再次缓慢加入37℃预热的生长培养液重悬细胞。
（5）重复（3），（4）步骤两次以上。

3. 贴壁细胞的染色
（1）将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
（2）从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。
（3）在盖玻片的一角加入100 μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
（4）37℃孵育细胞2～20 min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20 min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
（5）吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10 min，然后吸干培养基。

4. 显微镜检测
（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS滤光器的选择: XF23-Omega, 31001-Chroma。
（2）多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：
a) DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；
b) DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；
c) DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005