小鼠胰岛Β细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠胰岛Β细胞来源于转基因小鼠中生长的一个胰腺肿瘤(胰岛素瘤)。这种小鼠携带了大鼠胰岛素II基因启动子调控的SV40早期基因的假基因结构。细胞包含丰富的胰岛素和小量的胰高血糖素及生长抑素。

小鼠胰岛Β细胞

小鼠胰岛Β细胞处理：

1）冻存小鼠胰岛Β细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）小鼠胰岛Β细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：

1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）小鼠胰岛Β细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

小鼠胰岛Β细胞可以用于基于小鼠胰岛β细胞系MIN6构建两种常用胰岛体外模型的比较研究

基于小鼠胰岛β细胞系Min6细胞构建无支架的细胞球和封装于海藻酸凝胶中的分散细胞二种不同的三维(three-dimensional,3D)细胞培养体系。与传统的二维(two-dimensional,2D)贴壁细胞相比,比较这三种培养方式下胰岛素分泌功能的差异并对其存在的机制进行初步的研究。

方法:(1)采用Solid-works设计出深度、直径可调的模具,利用3D打印技术制备出模具,并构建琼脂糖微孔矩阵培养3D Min6细胞球;

(2) 采用海藻酸钠封装MIN6细胞构建3D细胞微囊,采用Calcein AM/PI死活染色检测不同浓度的海藻酸钠水凝胶以及解交联剂对MIN6细胞微囊存活的影响;

(3) 采用Cell Titer-Glo(?)3D化学发光法评估MIN6细胞在不同浓度的海藻酸钠水凝胶以及2D,3D培养下的增殖差异;

(4) 扫描电子显微镜观察细胞球和海藻酸钠微囊的表面特征。

(5) 实验分组:2D组、细胞球组、细胞微囊组;

(6) Western blot、IF、RT-q PCR分别检测Min6细胞胰岛功能相关蛋白GLUT2、PDX1、Insulin(INS)和基因GLUT2、PDX1、INS2、NKX2.2的表达差异;

(7) 酶联免疫吸附实验ELISA检测葡萄糖刺激Min6细胞下的胰岛素分泌差异;

(8) Western Blot检测三种培养方式下胰岛素分泌相关信号通路PI3K/AKT/FoxO1的表达变化;

(9) Western Blot检测不同浓度的海藻酸钠封装的细胞胰岛素分泌相关信号通路PI3K/AKT/FoxO1的表达变化。

结果:(1)琼脂糖表面可形成整齐排列的微孔矩阵,MIN6细胞在微孔内可聚集形成大小均一,紧密的细胞球。

(2) 死活染色与增殖结果显示,1%(w/v)海藻酸钠水凝胶装封适合MIN6细胞生长。

(3) 增殖检测结果显示,二种3D培养均能有效促进MIN6细胞的增殖。

(4) 扫描电镜结果显示,细胞球之间细胞互相融合、紧密聚集成微组织,细胞在水凝胶基质上形成单层簇状或多细胞簇状在局部生长。

(5) 免疫荧光结果显示,GLUT2,PDX1,INS的信号强度,细胞球组最明显,水凝胶组和2D组差异不明显。

(6) ELISA结果显示高糖或低糖刺激下,与2D相比,3D培养促进胰岛素分泌量更高(P<0.05),其中水凝胶组胰岛素分泌高于细胞球组(P<0.05)。

(7) RT-q PCR结果显示,3D培养有利于促进GLUT2、PDX1、INS2和NKX2.2基因的表达,其中水凝胶组对基因表达的上调作用(P<0.001)。

(8) Western blot结果显示,MIN6细胞在不同培养条件下,GLUT2的表达无显著性差异,PDX1,INS表达趋势和RT-q PCR一致。

(9) Western blot结果显示,PI3K,p-AKT/AKT,p-FoxO1/FoxO1和PDX1蛋白的表达水平,水凝胶组明显高于其他两组(P<0.05)。其中,细胞球组的表达水平也比2D组高,统计没有显著差异。

（10）不同浓度水凝胶封装MIN6细胞,Western blot结果显示,PI3K的表达,0.5%和1%(w/v)差异不明显,2%(w/v)的显著降低(P<0.05);p-AKT/AKT,p-FoxO1/FoxO1,PDX1的表达1%表达最高(P<0.05),0.5%和2%(w/v)之间无显著性差异。

结论:成功构建了细胞球和适合海藻酸盐水凝胶封装细胞培养的二种三维培养方式;与传统的2D贴壁培养相比,三维培养条件下细胞增殖和胰岛相关基因和蛋白的表达显著增强,并促进胰岛素分泌。其中,封装于海藻酸钠凝胶中的细胞比细胞球高表达。

参考文献

[1]Advanced Strategies for 3D Bioprinting of Tissue and Organ Analogs Using Alginate Hydrogel Bioinks[J].Gao Qiqi;Kim ByoungSoo;Gao Ge.Marine Drugs,2021(12)

[2]The PI3K/Akt signaling axis in Alzheimer’s disease:a valuable target to stimulate or suppress?[J].Razani,Elham;Pourbagheri Sigaroodi,Atieh;Safaroghli Azar,Ava;Zoghi,Anahita;Shanaki Bavarsad,Mahsa;Bashash,Davood.Cell Stress and Chaperones,2021(prep)

[3]Mutant Huntingtin Impairs Pancreaticβ-cells by Recruiting IRS-2 and Disturbing the PI3K/AKT/FoxO1 Signaling Pathway in Huntington's Disease.[J].Li Li;Sun Yun;Zhang Yinong;Wang Weixi;Ye Cuifang.Journal of molecular neuroscience:MN,2021(prep)

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[5]晁新新.基于小鼠胰岛β细胞系MIN6构建两种常用胰岛体外模型的比较研究[D].南昌大学,2022.