依替巴肽的液相合成方法

背景技术

依替巴肽(Eptifibatide)由美国COR Therapeutic公司研发，1998年在美国上市，用于急性冠脉综合症(Acute Coronary Syndrome，ACS)的治疗。通过抑制凝血因子Ⅰ(Fibrinogen)，与血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受体结合，从而抑制血小板聚集。在临床应用中，对不稳定型心绞痛、急性心肌梗死、冠状动脉介入等心血管疾病的治疗均显示了良好疗效。目前，心血管疾病逐年增加已成为现代社会对人类健康威胁严重的常见病之一，作为具有药效高、毒副作用低、不会在体内蓄积中毒等优势的多肽药物，依替巴肽可有效减少心血管事件的发生率，降低死亡率，其临床应用将会越来越广。

目前已知的依替巴肽化学合成方法中，固相合成作为实验室研究是一个较好的方法，此方法高效、迅速，但固相合成原料利用率低，使用的试剂及溶剂昂贵、不易处理，用到的乙二硫醇、DMF等毒性较大不适合产业化生产。其中，采用Fmoc-Har-OH这一特殊氨基酸衍生物为起始原料，不但价格相当昂贵，而且由于侧链基团未保护，在有机溶剂中溶解性差，导致副产物增加，合成效率降低。此外，规模较小，仅局限在1L左右的反应体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能大规模制备依替巴肽的液相合成方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种依替巴肽的液相合成方法，包括合成三肽，合成四肽，合成七肽，环化，脱除保护基和胍基化六个阶段。

具体步骤如下：

1）合成三肽

将H-Cys(Trt)-NH2与Fmoc-Pro-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到二肽Fmoc-Pro-Cys(Trt)-NH2；然后脱除所述Fmoc-Pro-Cys(Trt)-NH2中的Fmoc保护基，得到H-Pro-Cys(Trt)-NH2；再将得到的所述H-Pro-Cys(Trt)-NH2与Fmoc-Trp-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到三肽Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2；

2）合成四肽

将Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2中的Fmoc保护基脱除，得到H-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2；然后将所述H-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2与Fmoc-Asp(OtBu)-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到四肽Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2；再将所述Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2中的Fmoc保护基脱除，得到四肽H-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2；

3）合成七肽

首先制备三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH：

将H-Gly-OMe与Cbz-Lys(Boc)-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到二肽Cbz-Lys(Boc)-Gly-OMe；然后将所述Cbz-Lys(Boc)-Gly-OMe  中的Cbz保护基脱除，得到H-Lys(Boc)-Gly-OMe；再将所述H-Lys(Boc)-Gly-OMe与Mpa(Trt)-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OMe；再将所述三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OMe用NaOH溶液水解，然后再依次用水和乙醚浸洗，得到三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH，其中所述水和乙醚质量比为3:1；

其次将四肽H-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2与三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到线性七肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2；

4）环化

将线性七肽环化得到环肽

5）脱除保护基

将溶于饱和的HCl和AcOEt溶液，脱除所述侧链β-羧基上的-OtBu和ε-氨基上的-Boc的保护基，得到环七肽盐酸盐

6）胍基化

将环七肽盐酸盐中Lys的侧链氨基在三氧化硫脲作用下转化为胍基，得到所述依替巴肽。

具体实施方式

Fmoc-Pro-Cys(Trt)-NH2的制备

将H-Cys(Trt)-NH2（MW 362.49，1.812g，5mmol）溶于10ml DCM中，搅拌下加入DIEA（MW 129.24，1.1ml，6mmol）；Fmoc-Pro-OH（MW 337.37，1.687g，5mmol）与HOCt(MW.157.13,0.943g,6.0mmol)溶于25ml DCM中，搅拌下缓缓滴加DIC(MW 126.20,0.91ml,6.0mmol)于上述溶液中，反应15min。然后将此混合溶液滴加至H-Cys(Trt)-NH2/DIEA/DCM混合液中，室温下搅拌4h，TLC检测反应完全。反应液过滤后用NaHCO3(0.2M,25ml*2)、盐酸(0.2M,20ml*2)及饱和食盐水(30ml)依次萃取，无水Na2SO4干燥，减压浓缩后得油状物，加Et2O放置，得白色固体Fmoc-Pro-Cys(Trt)-NH2。