脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测

背景及概述^[1][2]

呕吐毒素的主体成分为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，主要是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)产生的真菌毒素。1972年，日本的Morooka等人首次从赤霉病大麦中将其分离，Yoshizawa等L2 稍后阐明了它的结构，并将其命名为呕吐毒素(4deoxynivalenol，DON)。DON在全球范围内广泛存在，尤其是温暖潮湿地区的粮食及其制品中，如美国、加拿大以及我国华南等地 ，欧洲北部和中部的谷物DON检出率分别高达70％和66％L5 J，国内形势也不容乐观。

近年来，随着气候条件的恶化，DON逐步向北蔓延，在浙江、江苏、山东、河南等地的检出率不断升高。由于其稳定的化学性质、较强的热抵抗力、耐压、耐酸性，在加工过程中很难被除去，一直成为粮食生产加工过程中的隐患。我国国家标准GB 2762-2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量中规定DON限量为≤1000 g/kg，联合国粮农组织规定食用粮食中DON的含量<1000 kg。中国传统饮食习惯中粮比例大大高于西方，使得呕吐毒素的危害更为突出。

结构

性质^[1]

DON 的化学名为32，72，l5一三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，CAS：51481-10-8，分子式C₁₅H₂₀O₆，相对分子量296.32。属单端孢霉烯族化合物，化学性质稳定。可与核糖体60s亚基的肽转移酶活性中心结合引发核糖体应激反应，抑制DNA、RNA和蛋白的合成，诱导细胞凋亡等作用，对肠道、免疫系统造成破坏，并且具有遗传毒性，对人和动物的身体健康具有严重影响，是人畜食品中检出率和超标率最高的一种真菌毒素。DON具有很强的细胞毒性和免疫抑制性，对人和动物的健康构成了严重威胁，欧盟分类标准为三级致癌物。

危害^[3]

DON是已知的单端孢霉烯族化合物中毒性最强的一种对人类和动物均可造成危害，严重影响人和牲畜的健康。人类摄入了被DON污染的面粉及其制成的食品后，可能会引起呕吐、腹泻、头疼、头晕等以消化系统和神经系统为主的中毒症状，严重时会损害造血系统造成死亡。对于抵抗力较低的老人和儿童，其症状表现较为严重。有的病人还有乏力、全身不适，步伐不稳等似酒醉样症状，其慢性毒性表现为对胃癌细胞有一定的影响。

据流行病学调查表明：动物食用DON后，一般表现可引起实验动物食欲下降、体重降低、代谢紊乱等慢性中毒表现，并具有免疫毒性和生殖发育毒性。并导致血磷和碱性磷酸酯酶活性下降。联合国粮农组织和世界卫生组织早在1973年联合召开的第三次食品添加剂和污染物会议上，就将单端孢霉烯族毒素定为最危险的自然发生食品污染物。

检测^[1]

1. 薄层色谱法

薄层色谱法是最早建立的一种检测方法。GB/T 5009.111-2003ll 谷物及其制品中呕吐毒素的测定就采用了薄层色谱法，其检测限为1 mg/kg。适用于谷物如小麦、玉米、大麦等及其制品如蛋糕、饼干、面包等中呕吐毒素的测定。最低检出限为20 ixg/kg-300 g/kg。操作简便，但是也有一些缺点，如灵敏度差，处理样品时工作量大，且提取过程中需要使用大量的有机溶剂，适用于具有一定实验室条件的检测，对于基层粮食企业还存在局限性。

2. 试纸条/卡法

DON快速检测胶体金法应用胶体金比色技术免疫竞争反应原理，能够快速检测粮食及其加工制品中DON。主要有分为定性条法和定量条法。

1）定性条法 粮食企业单位根据需要选择如500、800、1000等限量的试纸条，通过结果的阴阳性判定样品中DON是否在某一定量限内。该方法价格低廉，操作简单快捷，对检验人员的实验技能要求不高，不需要配备额外的仪器设备，在粮食收购及入库过程中的把关及检验机构的前期大批量筛选中非常实用，是基层粮食企业的优质选择。

2）定量条法 定量条法同样基于竞争性免疫反应原理进行检测，根据试纸条上检测T线与质控C线的颜色深浅与样品中待检测物的含量之间的对应关系，通过手持式试纸条扫描读书仪读出最终结果，该方法检出限为250 g/kg，整个检测过程不到10 min。

3. 试剂盒法

试剂盒法基于间接酶联免疫原理，在酶标板微孔上预包被DON抗原，样本中的呕吐毒素和微孔上预包被的抗原竞争DON抗体(抗试剂)，同时呕吐毒素抗体与酶标二抗(酶标物)相结合，经TMB底物显色，样本吸光度值与其所含呕吐毒素含量呈负相关，由此可知样本中DON含量。检出限为200 g/kg，适用于大量样品的准确、快速分析。

4. 真菌毒素及重金属快速检测及监测分析系统

真菌毒素及重金属快速检测及监测分析系统也基于胶体金比色技术免疫竞争反应原理，除具备定量条法的所有优点外，完善了快检技术平台，可实现检测数据实时交互及在线检测，还可同时检测真菌毒素及重金属铅和镉。试纸条无苛刻的储存条件，实验简单快速，对检验人员的技术要求低，试剂环保安全，实验残余无污染。随着对粮食安全的逐渐重视，快速检测系统在粮食企业，尤其是基层粮食企业的应用前景将十分广阔。

5. 仪器法

1）气相色谱法气相色谱法检测DON具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点，还可同时检测单端孢霉烯族化合物及玉米赤霉烯酮等真菌毒素，但是变异系数大。早在1986年，AOAC就利用气相色谱法检测小麦中的DON含量，但气相色谱法尚存在一系列问题，有待标准化。

气相色谱法检测DON需要进行衍生化处理，实验繁琐负责，仪器设备昂贵，多在研究性机构或单位，在基层粮食企业的应用还存在一定的局限，技术上存在的问题也在一定程度上限制了其在粮食行业的推广应用。

2）高效液相色谱法 GB23503-200918中用提取液提取试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。该方法检测灵敏度高，操作步骤简单，不需要进行衍生化反应，逐渐代替了气相色谱法，但高效液相色谱仪器设备成本高，用时长，操作繁琐，需要专门人员操作，一次检测只能测定DON含量，不能同时检测DON衍生物。串联质谱后可同解决这一问题。

6. 其他方法

有学者不断尝试将近红外光谱及傅里叶转换红外光谱、荧光极性免疫等方法应用于DON 的快速检测分析。使用傅里叶转换红外光谱研究了DON含量在50 到16000~g/kg之间的样品，建立了一种快速、灵敏、准确的多路傅里叶转换红外光谱检测方法。这些方法大大简化了实验步骤，缩短了分析时间，但还有待近一步探索完善并最标准化，离在粮食行业中的推广应用还有一段距离。

主要参考资料

[1] 盛林霞, 付豪, 吴艺影, 等. 粮食中呕吐毒素检测方法的研究进展[J]. 粮食储藏, 2018, 47(1): 32-36.

[2] 鲍淑青, 张克英, 陈海军. 饲料中呕吐毒素的危害与防治[J]. 中国饲料, 2007 (17): 34-36.

[3] 孙秀兰, 邵景东, 王俊双. 粮油食品中呕吐毒素危害及风险分析[J]. 粮食与油脂, 2007 (3): 41-43.