维生素K2的制备方法

背景及概述^[1]

维生素K2生物合成途径是由异戊二烯侧链合成途径与萘醌骨架合成途径组合而成的。维生素K2具有良好的促进凝血、预防和治疗骨质疏松的功效，同时还能改善动脉硬化，对肝癌和白血病也有预防和治疗作用，早在1995年日本已经将维生素K2作为骨质疏松治疗药物。

制备^[1-2]

报道一、

（1）以黄杆菌1.6859为出发菌株，将黄杆菌培养在如下平板培养基（g/L）中进行活化：葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，PH自然；温度37℃，培养时间3天；

（2）将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释100倍，达到菌液中菌体浓度为每毫升含107个细胞，用微量移液器取该菌悬液0.1mL均匀涂布于无菌平皿上，置于超净工作台上自然风干，将平皿放入低能离子注入机的靶室中进行N+注入，注入能量为15kev，剂量为2.0×1015N+/cm2；同时以真空环境下未接受离子注入的样品作为对照；离子注入辐照后，在超净工作台上用1mL无菌生理盐水分别洗脱处理样品和对照样品，将洗脱得到的菌液用微量移液器分别取0.1mL菌液均匀涂布在初筛平板培养基（葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，1,4‑二羟基‑2‑萘甲酸80mg/L）上培养，在35℃下倒置培养3天，待长出单菌落后进行菌落计数并挑取生长速度快，直径大的菌落，接入发酵培养基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO40.3g/L，K2HPO44.5g/L，NaCl3g/L）上摇瓶发酵，将维生素K2产量高的菌株移至斜面培养基保藏；

（3）将上步骤获得高产量黄杆菌菌液取0.1mL于无菌空平皿中涂布均匀，吹干；将平皿放入低温空气等离子体放电装置中，抽真空到30Pa时开始等离子体放电，电源为13.56MHz的射频电源，功率为360W，放电20分钟后放入过滤后的无菌空气恢复柜内压力，取出样品；同时以真空条件下不接受等离子体放电处理的真空对照和未处理对照；在超净工作台上用1mL无菌生理盐水分别洗脱处理样品和对照样品，将洗脱得到的菌液用微量移液器分别取0.1mL菌液均匀涂布在初筛平板培养基（葡萄糖15g/L，马铃薯浸出液180g/L，甘油5g/L，琼脂20g/L，1,4‑二羟基‑2‑萘甲酸80mg/L）上培养，在35℃下倒置培养3天，待长出单菌落后进行菌落计数并挑取生长速度快，直径大的菌落，接入发酵培养基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO40.3g/L，K2HPO44.5g/L，NaCl3g/L）上摇瓶发酵；反复步骤（2）和步骤（3）2次后，获得黄杆菌菌株维生素K2产量提高80%；

（4）将步骤（3）获得的黄杆菌菌株接入种子培养基（甘油10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO41.5g/L，K2HPO41.5g/L）中在35℃培养1天，按接种量5%接入发酵培养基，并在发酵培养基中添加2%表面活性剂POE，胞内维生素K2可溶至胞外；然后摇瓶转速200转，35℃培养3天，维生素K2总产量提高150%。

报道二、

（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，30℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏2天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌，所述斜面培养基的配方为：甘油8g/L，蛋白胨8g/L，酵母提取物1.5g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L；

（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，每50mL种瓶培养基接种0.1立方厘米的斜面保藏菌，在30℃下摇瓶培养24小时，摇瓶转速120rpm，获得种瓶培养物，所述种瓶培养基配方为：甘油4g/L，蛋白胨4g/L，酵母提取物1.5g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.05g/L；

（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于28℃下发酵培养120小时，获得发酵液，每100ml发酵培养基接种4ml的种瓶培养物，发酵培养期间每隔20小时补加营养物质的重量百分比分别为：甘油0.05%、蛋白胨0.05%以及异戊二烯0.005%，发酵培养基的配方为：在上述种瓶培养基中添加聚氧乙烯油醚0.5g/L；

（4）取上述发酵液，加入明矾进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体；

（5）将湿菌体放在-15℃低温下冷冻3分钟，然后在室温中融化；

（6）重复上述步骤（5）2次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体；

（7）纯化：

a、用20mL正己烷对上述破碎菌体进行萃取，提取有机层并旋转蒸发，得到维生素K2粗品；

b、取维生素K2粗品，溶于5mL无水乙醇中，用溶胀好的HZ816树脂装柱30mL，连接紫外检测器和收集器，以3BV/h的流速将维生素K2粗品溶液倒入层析柱上，然后用100%工业乙醇对树脂进行洗脱，洗脱至紫外检测器所示数值恒定不变，此时大部分杂质基本被洗脱干净了，再用丙酮溶液将维生素K2洗脱下来，获得的丙酮洗脱液置于0℃下静置，即得到维生素K2粗分品；

c、将适量的硅胶装入层析柱中，硅胶装入层析柱的高径（直径）比为3：1，取维生素K2粗分品溶于体积比为10：1的正己烷和乙酸乙酯混合液的洗脱剂中，从层析柱顶端倒入，在柱子下端收集流出液，其中洗脱的流速为0.5BV/h；

（8）将上述纯品提取液干燥，获得维生素K2的纯品。

参考文献

[1][中国发明]CN201310280268.0一种利用黄杆菌高效生产维生素K2的方法

[2][中国发明,中国发明授权]CN201310521459.1一种维生素K2及其制备方法