小鼠支气管成纤维细胞提取物说明书

细胞培养操作规程：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
以下是小鼠支气管成纤维细胞提取物说明书的订购信息：

 小鼠支气管成纤维细胞提取物是从小鼠支气管成纤维细胞提取的，小鼠支气管成纤维细胞从正常小鼠支气管组织制备。所有的产品在发货之前均经过严格的QA/QC流程以确保其质量。这些产品可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。
总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。公司提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。

cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证了产品的质量。

蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备小鼠支气管成纤维组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。

潜在的应用： <1>已知基因的PCR克隆；<2>mRNA选择性剪接；<3>基因克隆与目标测序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白检测与蛋白质组学；<6>芯片研究与表达图谱。
实验报告：
一分离与培养：
    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
透明质酸Human ERK(ELK-Related Tyrosine Kinase) ELISA Kit

透明质酸Human ERK1(Extracellular Signal Regulated Kinase 1) ELISA Kit

10-羟基苯并[H]喹啉Human ERα(Estrogen Receptor Alpha) ELISA Kit

10-羟基苯并[H]喹啉Human ERβ(Estrogen Receptor Beta) ELISA Kit

4-羟基-2-丁酮Human ETRA(Endothelin Receptor A) ELISA Kit

4-羟基-2-丁酮Human ETRB(Endothelin Receptor B) ELISA Kit

吲唑-3-羧酸Human EXT1(Exostoses 1) ELISA Kit

吲唑-3-羧酸Human F1+2(Prothrombin Fragment 1+2) ELISA Kit

2-甲基-3-羟基-4-吡喃酮Human F13(Coagulation Factor XIII) ELISA Kit

2-甲基-3-羟基-4-吡喃酮Human F13B(Coagulation Factor XIII B Polypeptide) ELISA Kit

2-[2-(1-哌嗪基)乙氧基]乙醇Human F5(Coagulation Factor V/Plasma Factor V) ELISA Kit

2-[2-(1-哌嗪基)乙氧基]乙醇Human F7(Coagulation Factor VII) ELISA Kit

N-甲基-L-脯氨酸Human F9(Coagulation Factor IX) ELISA Kit

N-甲基-L-脯氨酸Human FⅫa(Activated Coagulation Factor Ⅻ) ELISA Kit

N-甲基-L-脯氨酸Human FABP7(Fatty Acid Binding Protein 7, Brain) ELISA Kit
小鼠支气管成纤维细胞提取物说明书 3-环已胺基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)灭蝇胺标准溶液 100μg/ml,u=2%S-Adenosyl-L-methionine

 3-环己氨基丙磺酸(CAPS)灭蝇胺标准溶液 10μg/ml,u=2%Tamm-Horsfall

 1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷氰草津 分析标准品，98%TAR DNA binding protein 43

 2,2-双二羟甲基苯胺(Bis-tris)霜脲氰 分析标准品，98.5%Tau protein

 N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸（Bicine）顺式氯氰菊酯  分析标准品，99%TIM-1

 N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸(ADA)四螨嗪 分析标准品，98.6%Toll-like receptor 2

 N-(乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)四螨嗪标准溶液 100μg/ml,u=4%Toll-like receptor 4

 PH缓冲剂四螨嗪标准溶液 10μg/ml,u=6%Toll-like receptor 6

 3-吗啉丙磺酸灭幼脲 分析标准品，97%Toll-like receptor 7

 4-羟乙基哌嗪乙磺酸灭幼脲标准溶液 100μg/ml,u=4%，丙酮Toll-like receptor 9

 标准品灭幼脲标准溶液 10μg/ml,u=6%，丙酮TWIST1

哌昔洛韦克百威 分析标准品，99%（剧毒品）TWIST

 马喷特罗克百威标准溶液 100μg/ml,u=3%（剧毒品）CD3,CD4,CD8
培养操作：
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。  
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取.