人牙周膜成纤维细胞提取物说明书

细胞培养操作规程：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
以下是人牙周膜成纤维细胞提取物说明书的订购信息：

人牙周膜成纤维细胞提取物是从人牙周膜成纤维细胞提取的，人牙周膜成纤维细胞从正常人牙周膜组织制备。正常人牙周膜组织采集自各地方医院，采集工作根据IRB 和 HIPAA批准的方案进行。所有的产品在发货之前均经过严格的QA/QC流程以确保其质量。这些产品可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。
总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。公司提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。

cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证了产品的质量。

蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备人牙周膜成纤维组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。

潜在的应用： <1>已知基因的PCR克隆；<2>mRNA选择性剪接；<3>基因克隆与目标测序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白检测与蛋白质组学；<6>芯片研究与表达图谱。
实验报告：
一分离与培养：
    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醛Human APAF1(Apoptosis Protease Activating Factor 1) ELISA Kit

1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醛Human Apo A1-Ab(Anti-Apolipoprotein A1 Antibody) ELISA Kit

六氯乙烷Human ApoF(Apolipoprotein F) ELISA Kit

氢化可的松Human APT(Abnormal Prothrombin) ELISA Kit

氢化可的松Human ARHGDIα(Rho GDP Dissociation Inhibitor Alpha) ELISA Kit

氢化可的松Human ARO(Aromatase) ELISA Kit

十六烷基三甲基溴化铵Human ARRβ1(Arrestin Beta 1) ELISA Kit

十六烷基三甲基溴化铵Human ASGR2(Asialoglycoprotein Receptor 2) ELISA Kit

间羟基苯甲酸Human ASK-1(Apoptosis Signal Regulating Kinase 1) ELISA Kit

间羟基苯甲酸Human AST(Aspartate Aminotransferase) ELISA Kit

2-羟基-3-萘甲酸Human ATA(Angiotensinase A) ELISA Kit

2-羟基-3-萘甲酸Human ATF-1(Activating Transcription Factor 1) ELISA Kit

D-对羟基苯甘氨酸Human ATF-2(Activating Transcription Factor 2) ELISA Kit

D-对羟基苯甘氨酸Human ATF-3(Activating Transcription Factor 3) ELISA Kit

D-对羟基苯甘氨酸Human ATF-4(Activating Transcription Factor 4) ELISA Kit
人牙周膜成纤维细胞提取物说明书 异戊烷二甲基丙烯酸二乙二醇酯 96%apelin 12

 1.3－氯丙醇－2甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯, 包含100 ppm 吩噻嗪, 99%apelin 13

 1,3-二氯-2-丙醇丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯, >90%(GC),含1000ppmMEHQ稳定剂apelin 36

 1-氯丙醇二丙烯酸二乙二醇酯 75%Argonaut2

 2-甲基-2-丁硫醇丙烯酸二甲基氨基乙酯 99%ATPase

 3-氯丙烯醇丙烯酸 N,N-二乙基氨基乙酯 95%DHX9

 2-氯乙醇甲基丙烯酸二甲氨乙酯 99%B7-1

 异丙硫醇丙烯酸-2-苯氧基乙酯 90%B7-H6

 异戊基硫醇甲基丙烯酸异辛酯 99%B7-H1

 正辛基硫醇甲基丙烯酸甲氧基乙酯 98%,含60-100ppmMEHQ稳定剂B7-H2

 1,4-丁内酯丙烯酸-2-甲氧乙基酯 98%B7-H3

 2,4-甲苯二异氰酸酯二丙烯酸乙二醇酯 90%Bcl-2 associated X protein

 2.6-甲苯二异氰酸酯甲基丙烯酸乙酯 99%BH3 interacting domain death agonist
培养操作：
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。  
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取.