细胞培养操作规程:
一.培养基及培养冻存条件准备:
1)准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号21875-091),90%;优质胎牛血清,10%。
2)培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配,液氮储存。
二.细胞处理:
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于悬浮细胞,传代可参考以下方法:
方法一:收集细胞,1000RPM,常温条件下离心5分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
以下是人角膜上皮细胞提取物说明书的订购信息:
产品名称
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规格
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货号
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人角膜上皮细胞提取物说明书
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详见说明书
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FSX6705
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人角膜上皮细胞提取物是从人原代角膜上皮细胞提取的,人原代角膜上皮细胞从正常人角膜上皮组织制备。正常人角膜上皮组织采集自各地方医院,采集工作根据IRB 和 HIPAA批准的方案进行。所有的产品在发货之前均经过严格的QA/QC流程以确保其质量。这些产品可以直接用于基因克隆,表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。
总RNA制备:利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA,然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。公司提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。
cDNA制备:纯化后的总RNA来合成cDNA链,以50ul总反应体系进行逆转录,体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA,1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析,保证了产品的质量。
蛋白制备:利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备人角膜上皮组织裂解液,离心去除组织碎片,通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度,组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF,-80度保存。
潜在的应用: <1>已知基因的PCR克隆;<2>mRNA选择性剪接;<3>基因克隆与目标测序;<4> Western and Northern Blot;<5>蛋白检测与蛋白质组学;<6>芯片研究与表达图谱。
实验报告:
一分离与培养:
1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,最后将组织剪成1mm3左右大小;
2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置;
3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织完全被消化;
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养;
5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养;
二、免疫荧光鉴定:
1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min;
2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;
3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min;
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗,然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜;
5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗, 37℃条件下放置1h;
6、用PBS冲洗3次,每次10min,最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
四甲基氟代脲六氟磷酸酯Human ACAN(Aggrecan core protein) ELISA Kit
糠醇Human KLK7(Kallikrein-7) ELISA Kit
糠醇Human FPR2(N-formyl peptide receptor 2) ELISA Kit
糠醇Human BTK(Tyrosine-protein kinase BTK) ELISA Kit
糠醇Human PRKACA(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha) ELISA Kit
5-氟胞嘧啶Human ANGPTL2(Angiopoietin-related protein 2) ELISA Kit
5-氟胞嘧啶Human CCR4(C-C chemokine receptor type 4) ELISA Kit
5-氟-2-甲基苯并噁唑Human OGDH(2-oxoglutaRate dehydrogenase, mitochondrial) ELISA Kit
5-氟-2-甲基苯并噁唑Human ROMO1(Reactive oxygen species modulator 1) ELISA Kit
糠醛Human THRA(Thyroid hormone receptor alpha) ELISA Kit
2-氟-6-甲基吡啶Human FH(FumaRate hydRatase, mitochondrial) ELISA Kit
2-氟-6-甲基吡啶Human GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ELISA Kit
芴甲氧羰酰基-6-氨基己酸Human LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein) ELISA Kit
芴甲氧羰酰基-6-氨基己酸Human AANAT(Serotonin N-acetyltransferase) ELISA Kit
芴甲氧羰酰基-6-氨基己酸Human APEX1(DNA-(apurinic or apyrimidinic site)lyase) ELISA Kit
人角膜上皮细胞提取物说明书 Pirimiphos-methyl D6二甲基硅油DC-200 粘度~200 mPa.s, neat(25 °C)GGT ELISA Kit
碳酸盐pH标准缓冲溶液 (pH10.01)二甲基硅油DC-200 粘度~500 mPa.s, neat(25 °C)GGCT ELISA Kit
四硼酸盐pH标准缓冲溶液 (pH9.18) 二甲基硅油DC-200 粘度~1000 mPa.s, neat(25 °C)γ glutamylcysteine synthetase,γ-GCS ELISA Kit
1,3-二甲基巴比妥酸二甲基硅油DC-200 粘度~60000 mPa.s, neat(25 °C)IFI16 ELISA Kit
香豆素 498壬基酚聚氧乙烯醚 Type NP-7monocyte interferon gamma inducing factor,MIG ELISA Kit
聚二甲基硅烷担载的钯/氧化铝混合催化壬基酚聚氧乙烯醚 Type NP-9Interferon γ Receptor,IFN-γR ELISA Kit
BOC-3,5-DIIODO-TYR-OSU壬基酚聚氧乙烯醚 Type NP-10IFN-γ antibody ELISA kit
(3-BroMophenyl)(2,4,6-triMethylphenyl)iodoniuM triflate3-氯-4-氟苯胺 99%IFN-γ ELISA Kit
1,2-Bis[Bis[3,5-Bis(Trimethylsilyl)Phenyl]Phosphino]Benzene 2,3-二甲氧基苯甲酸 99%PION ELISA Kit
Dichloro[8-(di-tert-butylphosphinooxy)quinoline]palladium(II) 对羟基苯甲酸丙酯钠 USP,Ph Eurγ-Secretase ELISA kit
DL-α-Tocopherol methoxypolyethylene glycol succinate solution 3,4,5-三甲氧基甲苯 98%Gamma-aminobutyric acid,GABA ELISA Kit
6-METHOXY-2-OXO-1,2,3,4-TETRAHYDROQUINOLINE-4-CARBOXYLIC ACID1,2,4-苯三酸酐 97%BTRC ELISA Kit
2-(4-BOC-PIPERAZINYL)-2-(2-TRIFLUOROMETHYL-PHENYL)ACETIC ACID3-氯-2-甲基-1-丙烯 97%ARRB2 ELISA Kit
培养操作:
1)复苏细胞:将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻,加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟,弃去上清液,补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜(或将 细胞悬液加入 10cm 皿中,加入约 8ml 培养基,培养过夜)。第二天换液并 检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达 80%-90%,即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分 变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟,弃去上清液,补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1:2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类;
1. 细胞冻存时,弃去培养基后,PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶,细胞变圆 脱 落后,加入 1ml 含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞,根据细胞数量加 入血 清和 DMSO,轻轻混匀,DMSO 终浓度为 10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液,注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中,放入-80 度冰箱,2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取.