人冠状动脉内皮细胞提取物培养

细胞冻存：
对培养的细胞进行冻存的方法是将细胞置于含有(DMSO)等冷冻保护剂的完全培养基中于液氮中储存。冷冻保护剂可降低培养基的冰点，并可减缓冷却速度吗，大大降低冰晶形成的危险  (冰晶可损伤细胞，导致细胞死亡)。
注：DMSO 可促进有机分子进入组织。操作含DMSO的试剂时，应采用与此类物质安全危害相适应的设备和操作规范，并应按照当地法规处置此类试剂。 
细胞冻存指导原则
冻存细胞系以备将来之用时，必须遵守以下原则。与其他细胞培养操作一样，我们建议您严格遵守您所用细胞系附带的操作说明，以便获得结果。 
1）在高细胞浓度情况下进行培养细胞的冻存，并且细胞传代次数尽可能少。确保冻存前活细胞百分比至少为90%。请注意冻存条件取决于所用细胞系。 
2）细胞应缓慢冷冻，可使用可控制降温速度的低温冰箱或者低温冷冻容器使温度每分钟大约降低1°C。
3）必须使用推荐的冻存培养基。冻存培养基中应含有 DMSO 或者甘油等冷冻保护剂
4）将冷冻的细胞于 -70°C 以下温度储存；温度高于 -50°C 时，冷冻的细胞将开始变质。 
5）必须使用无菌冻存管储存冷冻的细胞。装有冷冻细胞的冻存管可浸于液氮或者在液氮上方的气相空间内保存 
6）必须穿戴个人防护设备。 
7）所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。必须采用正确的无菌技术，并且在层流通风橱内进行。
人冠状动脉内皮细胞提取物是从人原代冠状动脉内皮细胞提取的，人原代冠状动脉内皮细胞从正常人冠状动脉内皮组织制备。正常人冠状动脉内皮组织采集自各地方医院，采集工作根据IRB 和 HIPAA批准的方案进行。所有的产品在发货之前均经过严格的QA/QC流程以确保其质量。这些产品可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。
总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。公司提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。

cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证了产品的质量。

蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备人冠状动脉内皮组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。

潜在的应用： <1>已知基因的PCR克隆；<2>mRNA选择性剪接；<3>基因克隆与目标测序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白检测与蛋白质组学；<6>芯片研究与表达图谱。

操作流程：
1.1 主要试剂与仪器：倒置相差显微镜（日本 olympus imt-413），co2孵箱（日本yamato it-61）。
1.2 hek-293细胞的复苏培养传代及冻存：
1.2.1 细胞的复苏培养 从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/ml密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％co2及饱和湿度下培养。
1.2.2 细胞传代 原代培养的hek－293细胞48h换液1次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。
1.3 细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。
1.4 细胞的计数 常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用pbs重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，用10×物镜观察计数板四角大方格细胞数，按公式计算出细胞数。细胞数/ml原液＝(四方格细胞数之和/4) ×104。
1.5 细胞的贴壁率 指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×100％，计算贴壁率。 
1.6 生长曲线 取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1ml培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线

益康唑Human DPP9(Dipeptidyl peptidase 9) ELISA Kit

乙基三苯基碘化膦Human DUOX1(Dual oxidase 1) ELISA Kit

乙基三苯基碘化膦Human MAT2A(S-adenosylmethionine synthase isoform type-2) ELISA Kit

盐酸二乙胺Human AHCY(Adenosylhomocysteinase) ELISA Kit

伊文思蓝Human ERAP1(Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1) ELISA Kit

伊文思蓝Human PMP22(Peripheral myelin protein 22) ELISA Kit

2,4-二甲基吡咯-3-羧酸乙酯Human IAA(Insulin Autoantibodies) ELISA Kit

2,4-二甲基吡咯-3-羧酸乙酯Human SCGB2A2(Mammaglobin-A) ELISA Kit

丙炔酸乙酯Human ERRFI1(ERBB receptor feedback inhibitor 1) ELISA Kit

丙炔酸乙酯Human TYROBP(TYRO protein tyrosine kinase-binding protein) ELISA Kit

利尿酸Human PEBP1(Phosphatidylethanolamine-binding protein 1) ELISA Kit

利尿酸Human SLC45A1(Proton-associated sugar transporter A) ELISA Kit

1,2-乙二硫醇Human FTO(Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase FTO) ELISA Kit

1,2-乙二硫醇Human SLC30A3(Zinc transporter 3) ELISA Kit

红霉素Human PGR(Progesterone receptor) ELISA Kit
人冠状动脉内皮细胞提取物培养 雷公藤甲素金属锰片  99.9% metals basis,不规则片状transglutaminase 6 antibody IgM ELISA kit

 连翘苷 四氧化三锰 SPTransglutaminase 2 antibody IgG ELISA kit

 连翘脂苷A四氧化三锰 Mn ≥71.0%,  BET surface Area 5～7 m2/g  Transglutaminase 2 antibody IgA ELISA kit

 莲心碱高氯酸盐硫酸镍，七水  ACSGAD-Ab-IgM ELISA Kit

 硫酸长春碱4-羟基吡啶 97%glutamic acid decarboxylase autoantibody IgG,GAD-Ab-IgG ELISA Kit

 硫酸长春新碱硫代苹果酸 98%GAD65 antibody IgG ELISA Kit

 龙胆苦苷次磷酸钠 AR,99.0%glutamic acid decarboxylase 65,GAD65 ELISA Kit

 龙血素B乙醇镁 98%glutamic acid decarboxylase,GAD ELISA Kit

 芦荟大黄素碲化镉 99.9999%，6Nglutamate receptor,NMDAR ELISA Kit

 芦荟甙碲化铅 99.99%GOT2 ELISA Kit

 芦竹碱L-谷氨酰胺 99%GCLM ELISA Kit

 绿原酸透明质酸钠 95%，来源：鸡冠NR-2 Antibody ELISA Kit

 氯化两面针碱甲基嘧啶磷 0.100mg/mlNR-2 ELISA Kit
细胞培养的优点：
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。
2.研究条件可以人为控制
pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，可以根据实际需要进行人为的控制，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。
3.研究的样本可以达到比较均一性
通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。
4.研究内容便于观察、检测和记录
采用各种研究技术：如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备。