大鼠角膜上皮细胞说明书

细胞培养操作规程：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
以下是大鼠角膜上皮细胞说明书的订购信息：

       产品描述：公司提供的原代细胞均来自新鲜组织，公司提供的人源原代细胞均来自新鲜组织，用于培养该细胞的组织采集是根据国际标准方案进行。细胞的培养采用公司PrimaCellTM原代细胞培养试剂盒来优化目的细胞生长条件，以降低杂细胞的污染，同时保证质量的稳定。在公司技术部标准的操作流程下，原代细胞可以保持分化状态，进而可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。

      发货：客户可根据自身科研项目的需要选择不同类型的细胞培养瓶和相应的细胞密度。公司提供的细胞有标准的鉴定流程，保证细胞的纯度在90%以上，且不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。发货的新鲜细胞还包含:1、发货的T25方瓶中装满50ml左右完全培养基；2、说明书及注意事项；3、公司售后服务标准。

      保存和应用：客户可以根据自己的需求选择新鲜或者冻存的原代细胞，如是新鲜原代细胞，客户收到细胞后应立即将其放入CO2细胞培养箱内静置后2-3h，再进行后续的实验操作。如是冻存细胞，客户收到细胞后应立即将其放入液氮、-80℃冰箱或立即进行复苏。该细胞只可用于科研，不得用于临床应用。
实验报告：
一分离与培养：
    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
二甲基二烯丙基氯化铵 溶液Human MIP-1α(Macrophage Inflammatory Protein 1 Alpha) ELISA Kit

1,2-二氯乙烷Human MIP-3a/CCL20(Macrophage Inflammatory Protein 3 Alpha) ELISA Kit

1,2-二氯乙烷Human MMP-1(Matrix Metalloproteinase 1) ELISA Kit

1,2-二氯乙烷Human MMP-12(Macrophage metalloelastase) ELISA Kit

1,2-二氯乙烷Human MMP13(Matrix Metalloproteinase 13) ELISA Kit

1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-羧酸乙酯,Human MMP-3(Matrix Metalloproteinase 3) ELISA Kit

葡萄糖,一水合物Human MMP-7(Matrix Metalloproteinase 7) ELISA Kit

Diacetato[(S)-(-)-5,5'-bis(diphenylphosphino)-4,4'-bi-1,3-benzodioxole]ruthenium(II),Ru(OAc)2[(S)-segphos]Human MMP-8(Matrix Metalloproteinase 8) ELISA Kit

Diacetato[(S)-(-)-5,5'-bis(diphenylphosphino)-4,4'-bi-1,3-benzodioxole]ruthenium(II),Ru(OAc)2[(S)-segphos]Human MMP-9(Matrix Metalloproteinase 9) ELISA Kit

二安替吡啉甲烷Human MYD88(Myeloid differentiation primary response protein MyD88) ELISA Kit

1,8-二溴萘Human KLK10/NES1(Kallikrein-10) ELISA Kit

1,8-二溴萘Human NGF/NGFβ(Beta-nerve growth factor) ELISA Kit

DL-丙氨酸Human NID-1(Nidogen-1/Entactin) ELISA Kit

3,5-二氯-2-氟吡啶Human NT-3(Neurotrophin-3) ELISA Kit

3,5-二氯-2-氟吡啶Human NT-4(Neurotrophin-4) ELISA Kit
大鼠角膜上皮细胞说明书Brucella Ab IgG(Human Brucella Antibody IgG) ELISA Kit  人布鲁氏菌抗体IgG硫藤黄素  95% GROα/MGSA ELISA Kit

BrdU(Mouse Bromodeoxyuridine) ELISA Kit  小鼠溴脱氧核苷尿嘧啶缬氨霉素 ≥98% (TLC), ≥95% (HPLC), solidGlomerular tissue extract-advanced glycosylation end products,GTE-AGE ELISA Kit

BrdU(Human Bromodeoxyuridine) ELISA Kit  人溴脱氧核苷尿嘧啶蛎灰菌素A 95%Kim-1 ELISA Kit

BrdU ELISA Kit   大鼠溴脱氧核苷尿嘧啶渥曼青霉素  98%renin precursor ELISA kit

BRCA-2(Human breast cancer susceptibility protein 2) ELISA Kit  人乳腺癌易感蛋白2玉米烯酮 99%renin,REN ELISA Kit

BRCA-1(Human breast cancer susceptibility protein 1) ELISA Kit  人乳腺癌易感蛋白1ALPHA-玉米赤霉烯醇  97%Proadrenomedullin,Pro-ADM ELISA Kit

BRAK/CXCL14(Human Breast and kidney expressed chemokine,BRAK) ELISA Kit  人胸肾表达趋化因子乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯 95%adrenomedullin,ADM ELISA Kit

BPI-Ab(Human anti-Bactericidal permeability increasing protein antibody) ELISA Kit  人抗杀菌通透性增高蛋白抗体己二酸 Standard for GC,≥99.5%(GC)adrenergic alpha-1A receptor,ADRA1A ELISA Kit

BP180-Ab(Human anti-Bullous Pemphigoid 180 antibody) ELISA Kit  人抗BP180抗体己二酸  AR，≥99%(HPLC)Epinephrine/Adrenaline,EPI ELISA Kit

BP(Human Bullous Pemphigoid) ELISA Kit  人大疱性类天疱疮抗体己二酸 超纯级，≥99.5% (HPLC)adrenal cortex antibody,ACA ELISA Kit

Bombyx mori Livetin,LT ELISA Kit  家蚕卵黄蛋白己二酸 药用级, 99.6-101.0%Nephrin ELISA Kit

BNP(Human brain natriuretic peptide) ELISA Kit  人脑钠素/脑钠尿肽己二酸 ≥99.6%, FCCRenalase/ Monoamine Oxidase-C,RNLS/MAO-C ELISA Kit

BNP ELISA Kit  大鼠脑钠素/脑钠尿肽1,2,4-苯三酸酐 97%neuron axon filament protein你
培养操作：
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。  
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取.