潮霉素B

1、 储存液制备
（1）潮霉素 B（粉末形式）：称取适量粉末溶于 1×PBS 配制成 50mg/ml 溶液，用 0.22μm 滤膜过滤除菌，置于 2-8°C 避光保存。
（2）潮霉素B（溶液形式）：已是无菌储存液，直接用细胞培养液稀释到工作浓度即可使用。
2、 建议工作浓度
潮霉素B 用来筛选稳定转染细胞株的工作浓度需要根据细胞类型，培养基，生长条件和细胞代谢率而变化。
（1）哺乳动物细胞 使用浓度为 50-1000 μg/ml，常用筛选浓度为 200 μg/ml，浓度需要杀灭曲线来确定。
（2）植物细胞 常用浓度：20-200 μg/ml；
（3）细菌常用浓度：20-200 μg/ml；
（4）真菌 常用浓度：200-1000 μg/ml；
3、 杀灭曲线的建立
建议初次实验一定要建立杀灭曲线（kill curve），至少设立 5 个浓度，筛选到适合自身实验体系的浓度。
（1）将未转化细胞按照 20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，铺足够的孔以保证后续的梯度实验。37℃ 培养过夜；【注意】：对于需要更高密度以保证活力的细胞，增加接种量。
（2）第二日，用含梯度浓度潮霉素 B 的培养基替换旧培养基。比如，哺乳动物细胞常用浓度为 50-1000μg/ml， 可设 50, 100, 250, 500, 750, 1000μg/m 这 6 个浓度，各 3 个平行。同时设置一阴性对照，3 个平行。
（3）接下来每 3-4 日更换新鲜的含抗生素培养基。
（4）按照固定周期（如每 2 天）进行活细胞计数来确定阻止未转化细胞生长的恰当浓度。选择在理想天数（通常是 7-10 天）内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选所需的工作浓度。
4、 稳转细胞的筛选
（1）转染 48h 后，用含筛选浓度潮霉素 B 的培养基进行细胞传代。【注意】：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果。当细胞密度过高，筛选效率会降低。为了得到较好的筛选效果，建议将细胞稀释至丰度不超过25%。
（2）每 3-4 日更换新鲜的含抗生素培养基。
（3）筛选 7 天后观察并评估细胞集落的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这些取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。
（4）挑取 5-10 个抗性克隆到 35mm 细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。
（5）之后换用正常培养基培养即可。

1. The structural basis for the action of the antibiotics tetracycline,
pactamycin, and hygromycin B on the 30S ribosomal subunit.
Brodersen, D. E., Clemons Jr, W. M., Carter, A. P., Morgan-Warren, R. J., Wimberly, B. T., & Ramakrishnan, V.
Cell, 103(7), 1143-1154. (2000).

2. Resistance to hygromycin B.
Waldron, C., Murphy, E. B., Roberts, J. L., Gustafson, G. D., Armour, S. L., & Malcolm, S. K.
Plant Molecular Biology, 5(2), 103-108. (1985).