活性氧检测试剂盒(DHE荧光探针法)

活性氧检测试剂盒(DHE荧光探针法)

中文名称：活性氧检测试剂盒(DHE荧光探针法)

英文名称：ROS detection kit(DHE probe)

产品规格：200T

本试剂盒是一种利用荧光探针DHE(Dihydroethidium)进行活性氧检测的试剂盒。可以用于各种真核培养细胞、培养或灌流组织及组织冰冻切片的检测，提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。

DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。在激发波长535nm，发射波长610nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内活性氧水平。

活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

产品特点：
· 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
· 背景低，灵敏度高；
· 线性范围宽，使用方便。

试剂盒组成：

保存条件：-20℃避光，有效期6个月

自备试剂和仪器：
· 培养基
· 移液器及吸头
· 离心机
· 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长535nm，发射波长610nm。

使用注意事项：
1．螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2．荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
3．探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
4．尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
5．对于药物作用时间较短(2小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。
6．阳性对照诱导剂可以按照1:1000 的比例使用。例如标记好探针的细胞共1ml，可以加入1μl的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后20-30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照诱导剂的浓度。
7．DHE在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
8．对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化。

使用方法：

DHE探针标记：
1．DHE 溶液可在新鲜培养液、缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度，100～1000倍稀释，以此染色液更换细胞培养液或灌流液；也可直接向细胞孵育液体或灌流液中加入DHE探针溶液至所需浓度。
2．依据细胞ROS含量的不同，DHE 终浓度可选择在100-1000倍稀释的范围，孵育时间可选择10～90分钟，在37℃或室温进行避光孵育。
3．孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞或组织。

荧光显微镜检测：
1．对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25～50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
2．荧光显微镜下，用蓝光或绿光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像，ROS阳性细胞在整个核区被染成红色；用紫外光激发时，胞浆中未氧化的二氢乙啶可发出蓝色荧光。

流式细胞仪分析：
1．对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5～1 ml 冰冷PBS 重悬细胞（5～10万）。
2．采用480～535nm 波长激发，测定590nm～610nm 以上的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS阳性细胞有较强的红色荧光。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！