XTT细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒

中文名称：XTT细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒

英文名称：XTT Cell Proliferation And Cytotoxicity Detection Kit

产品规格：500次

XTT能被活细胞里的线粒体脱氢酶降解而产生橙黄色水溶性的甲臜，通过测定甲臜的光谱吸收，进而可以测定细胞的增殖情况。XTT与MTT同属四唑氮衍生物，它们检测细胞活性的反应原理相似，原理图如下：


产品特点：
1．盒灵敏度，可检测低细胞密度样品，检测结果的重复性优于MTT。
2．操作简便、快捷。可直接加入到检测平板。在96-孔板中检测时，无需洗涤或收获细胞，免去溶解步骤。
3．无放射性。不需要配制液闪混合物，也不需要处理废弃物。
4．与MTT相比，使用更安全。不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲基产物。

试剂盒组成：

储存条件：低温运输、-20℃保存(但溶液B也可以常温运输和保存)，有效期一年。

使用方法：
下面操作是检测细胞毒性的试验，其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验)，操作步骤可以以此为基础稍作修改即可，故不再赘述。

㈠、接种细胞
1．按常规胰酶消化法消化汇合的单层细胞，收集到含血清的培养基中。
2．200g离心5分钟收集细胞沉淀。
3．用培养基重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬浮液并计数。
4．将细胞稀释到2.5×103个/mL～5×10个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定)，如果不知道生长数度，一般可以稀释到1×10个/mL。
5．将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。
6．用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞，则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。
 注意：一定要把细胞加在孔的正中，否则细胞会聚集在孔的角落处，影响试验。
7．用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零)，第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11列反应的影响。
8．按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天，使细胞进入指数生长期。

㈡、药物处理
9．用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度，则需要预试验确定)，一般一种药物需要做3块平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培养基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基，这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物，每列加入一个浓度的药物。
13．按常规方法把96孔板继续放在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间，此段时间即为药物处理细胞的时间，由用户自己决定。
14．处理结束后去除第2到第11列(共10列，均含细胞)所有孔中的培养基，并再加入100μL新鲜培养基。
15．每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。

㈢、存活细胞计数
16．在生长末期，去除第1到第11列各孔中的培养基后，再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分)，用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。
 注意：溶液A在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解，摇匀后使用。MTT有致癌性，一定要带手套操作。
17．小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收，尽可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置摇床上低速振荡10分钟，使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。
19．由于产物不稳定，故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。
 注意：用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。
20．计数同样处理的各次重复的平均值。
21．以药物浓度为横轴，以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度绝对值差别很大，一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为100%)，这样便于计算出IC50，用于各种药物处理效果的比较。
 注意：如果测生长曲线，则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型，具有促进作用的则斜率加大。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！