TUNEL细胞凋亡检测试剂盒

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒

英文名称： TUNEL
中文名称：TUNEL细胞凋亡检测试剂盒
别    名：TUNEL Apoptosis Assay Kit; In Situ Cell Death Detection Kit;  
保存条件：Store at -15 to -25℃

The In Situ Cell Death Detection Kit, POD is based on the detection of single- and double-stranded DNA breaks that occur at the early stages of apoptosis. Apoptotic cells are fixed and permeabilized. Subsequently, the cells are incubated with the TUNEL reaction mixture that contains TdT and fluorescein-dUTP. During this incubation period, TdT catalyzes the addition of fluorescein-dUTP at free 3'-OH groups in single- and double-stranded DNA. After washing, the label incorporated at the damaged sites of the DNA is marked by an anti-fluorescein antibody conjugated with the reporter enzyme peroxidase. After washing to remove unbound enzyme conjugate, the POD retained in the immune complex is visualized by a substrate reaction.

凋亡是许多正常的生理过程所必需的，包括免疫系统的成熟和作用机制、组织器官和肢体的发生、神经系统的发生等过程。在许多病理条件下，凋亡机制的调节失衡起很重要的作用，包括组织细胞的缺血、缺氧、出血、中风、心脏病、癌症、艾滋病、自身免疫缺损和中枢神经系统的退行性变等。在癌基因的研究方面，由于细胞凋亡可由抗癌药物、放射及高热等启动，并且肿瘤细胞具有由于一些癌基因表达即能启动凋亡的内在特性，因此细胞凋亡已引起人们的广泛重视。
检测凋亡细胞的方法有数种。细胞凋亡过程中核酸内切酶的活化是关键的过程，导致核DNA被裂解成寡核苷酸大小的片段。因此，这个过程被用于检测凋亡，在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的“DNA梯形带”。但是，这种方法既不能检测单个细胞水平的凋亡，又不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态等方面的信息。
这一切可以由凋亡的原位酶标记方法来完成。DNA聚合酶和末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）用来标记DNA链断端的核酸，应用TdT进行的末端反应又称为ISEL或TUNEL技术，它与应用DNA聚合酶的ISNT（in situ nick translation）相比具有以下优点：灵敏度高、快速、优先标记发生凋亡的细胞，而不是坏死的细胞。
本试剂盒检测细胞凋亡分以下三个步骤：1、标记DNA链断端，由TdT催化，以FITC标记的核苷酸为原料，进行非模板依赖方式的3?OH端DNA末端聚合反应；2、用HRP或AP标记的羊抗FITC的抗体（Fab段）与聚合到DNA末端的FITC结合；3、用酶的底物显色，HRP常用DAB显色，AP常用BCIP/NBT显色。

方法：双抗夹心法

保质期：12个月

测定长度： 1-4.5小时 1-3.5小时

优点：

有竞争力的价格。             预稀释的检测试剂A和B

高灵敏度。                   减少进行测试时的步骤数

高稳定性。                   所有试剂均可在4℃下保存

保质期12个月。              与其他品牌相比反应更快

                             保质期12个月

包装描述：

测定步骤总结

1.准备所有试剂，样品和标准品；

2.向每个孔中添加100µL标准液或样品。在37℃下孵育2小时；

3.吸出并加入100µL准备好的检测试剂A。在37℃孵育1小时；

4.吸净并清洗3次；

5.加入100µL制备的检测试剂B。在37℃孵育1小时；

6.吸气并清洗5次；

7.添加90µL底物溶液。在37℃下孵育15-25分钟；

8.添加50µL终止液。立即在450nm处读取。

需自备的设备及试剂

450±10nm滤光片的酶标仪(建议仪器使用前提前预热)

单道或多道微量加液器及吸头

稀释样品的EP管

蒸馏水或去离子水

吸水纸

盛放洗液的容器

试剂盒的储存及有效期

未开封的试剂盒：所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意，收到试剂盒后请尽快将TMB 洗涤液，终止液保存于4℃，其他试剂保存于-20℃。

使用后的试剂盒：剩余试剂仍需按照试剂瓶标签所示的温度保存，开封后的酶标板要加干燥剂后密封保存于-20℃，避免潮湿。

稳定性

经测定，试剂盒在有效期内按推荐温度保存，其活性降低率小于5%。

为减小外部因素对试剂盒破坏前后检测值的影响，实验室的环境条件需尽量保持一致，尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。

注意：

试剂盒内酶标条可拆卸，按实验需求可分多次使用；使用后的剩余试剂盒建议在首次实验后 1个月内使用完毕。产品过期时间以盒子上的标签为准，保质期内所有组分都确保是稳定的。

ELISA实验常见问题分析

ELISA实验因灵敏度高，特异性强在生物科研上得到了广泛的认可，但对初学者而言，如不注意实验操作过程中的各个环节，可能会对最终的实验结果产生比较大的影响，比如实验出现白板，显色弱灵敏度低，花板无梯度背景高等现象。下面对以上实验现象进行一一解析。

1.白板现象

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。

出现该现象的可能原因：

a.试剂已过保质期，不同批次稀释液交叉使用。

b.错加漏加检测A，检测B或者底物溶液TMB。

c.洗板或者加样过程中，酶标记物被污染失活，稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。

d.配置稀释液的蒸馏水可能被污染。

e.洗涤液是浓缩型的，没有按比例进行稀释。

f.酶标记物的活性和效价比较低。

g.溶液的PH值不正确，一般稀释液的PH值应保持在7.2-7.4。

2.显色弱灵敏度低

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。

出现该现象的可能原因：

a.产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。

b.试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。

c.少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。

d.洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。

e.孵育时间和孵育温度未达到实验要求。

f.洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大，洗板浸泡时间过长。

g.底物溶液TMB显色时间太短。

3.花板无梯度背景高

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但没有梯度，背景也可能较高.

出现该现象的可能原因：

a.底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存，实验前溶液已经变蓝。

b.孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附。

c.没有按说明书要求洗板，特别是洗板时洗涤液的量少加了。

d.加样时没有换枪头造成交叉污染。

e.花板现象：低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体，封闭不足导致的本底不稳定，洗板不充分，包被板子的问题。

综上所述：在ELISA实验中应注意以下问题：

1.在实验前应该按相关要求将实验试剂平衡至室温。

2.包被抗体和检测抗体应该是有高活性的且都针对同一抗原。

3.试剂保存：蛋白抗体类试剂保存于-20摄氏度，显色液洗涤液保存于2-8摄氏度。

4.各试剂在使用前应充分混匀，以保证试剂的均一性和准确性。

5.严格控制反应温度和反应试剂。

6.洗板次数，洗板液的量，洗板液浸泡时间的长短，洗板的力度都是应该注意的问题。

7.相关浓缩液应按要求稀释到相应比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之间。

8.在终止反应时尽量避免微孔中存有气泡。

9.终止反应完成后应该在2min内完成酶标仪读数。