基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式)

基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式)

信裕生物的基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式)(Genomic DNA Mini Preparation Kit with Spin Column)是目前世界上的基因组DNA抽提试剂盒之一。可以抽提动物组织、鼠尾、培养细胞、细菌、酵母、动物血液、昆虫以及固定组织的包括基因组DNA在内的总DNA。一个试剂盒通过说明书中提供的不同操作方法，可以抽提除植物样品外的几乎所有样品中的总DNA。
样品首先被蛋白酶K消化，随后加入适合DNA结合到纯化柱上的缓冲液，然后加入到纯化柱内。通过高速离心，使DNA在穿过纯化柱的瞬间，结合到纯化柱上，随后通过两次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把DNA洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，样品裂解后仅需约15分钟即可完成。
通过本试剂盒纯化得到的基因组DNA的长度最长可达50kb左右，平均为30kb左右，最短为100bp的DNA也可以被纯化。如需获得更长的基因组DNA，对于哺乳动物样品，包括组织或细胞等，可以使用信裕生物生产的(D0061)哺乳动物基因组DNA抽提试剂盒。
通过本试剂盒获得的总DNA，OD260/OD280的范围通常在1.7至1.9之间。
本试剂盒可以抽提少至数百个细胞，多至25mg组织、0.5-1cm鼠尾、500万个培养细胞、20亿个细菌或5000万个酵母。样品用量过多，反而会影响抽提效果。如果待抽提样品的DNA含量小于5ng，建议加入适当量的carrier DNA，例如poly-dT或其它对后续实验没有干扰的DNA，也可以加入适当量的carrier RNA，例如yeast RNA等，以改善抽提效果。
本试剂盒的标准操作步骤抽提得到的总DNA会含有少量RNA，但如果按照可选步骤加入RNase A，就可以获得不含RNA的高纯度总DNA。含有RNA的总DNA可以用于PCR，但对于某些其它的后续反应可能会产生一些影响。
纯化柱对于DNA的容量约为30微克。通常每200万Hela细胞或500万淋巴细胞可以抽提得到15-25微克总DNA，每25mg肝、脑、肾组织可以抽提得到10-30微克总DNA，每25毫克心、肺组织可以抽提得到5-10微克总DNA，每10mg脾组织可以抽提得到5-30微克总DNA，每1.2cm小鼠尾尖或0.3cm大鼠尾尖可以获得10-25微克总DNA。
本试剂盒可以抽提50个样品的总DNA。
包装清单：

保存条件：
蛋白酶K-20℃保存，其余均室温保存。一年有效。蛋白酶K室温(15-25℃)存放一周，活力无明显下降。
注意事项：
抽提细菌、酵母样品时还需要一些特定的试剂，详情请参考相关实验步骤。
如需制备不含RNA的高纯度总DNA，需自备RNase A。
温度较低时样品裂解液A或样品裂解液B中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍。如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
次使用前洗涤液I需添加7ml无水乙醇，洗涤液II需添加24ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
本试剂盒需使用55℃水浴，请提前作好准备。
除特别说明外，每次Vortex应控制在5-10秒左右。
本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
参考如下使用说明，从某些样品中抽提总DNA不需要使用样品裂解液A。 
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明：
1. 从动物组织中提取总DNA
a．取不超过25mg的组织(脾不超过10mg)，剪切成尽可能小的碎片，加入180微升样品裂解液A。
请勿使用过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效果提高。新鲜或冻存的组织均可，但固定过的组织请参考后续的其它步骤进行。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1-3小时内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
c．清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升100mg/ml       RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
转录活性水平很高的组织例如肝和肾组织，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步骤(步骤1.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤d。
d．最高速剧烈Vortex 15秒。加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入样品裂解液B后需立即Vortex混匀。加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，但大多数情况在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、脾，在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需剧烈晃动或Vortex样品，以尽量破坏凝
胶状物。
e．加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。
加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
f．把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
g．加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
h．加入600微升洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
i．再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
j．将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-200微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在次用200微升洗脱液洗脱后，再用200微升洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10-80%，特别是当次洗脱下来的DNA大于10微克时，第二次洗脱可以获得次洗脱时50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
2. 从鼠尾中抽提总DNA
a．取0.4-0.6cm的大鼠尾尖一段，或小鼠尾尖最多两段，加入180微升样品裂解液A。
小鼠尾尖最长不能超过1.2cm，大鼠尾尖不能超过0.6cm。如果使用的是成年大鼠或小鼠，建议仅使用0.4-0.6cm长的尾尖。如果抽提鼠尾的DNA用genotyping，使用0.2-0.3cm长的尾尖已经足够。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。并确保鼠尾浸没在裂解液内。裂解完全通常需6-8小时。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
c．清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
鼠尾中RNA含量很低，但在不做清除RNA的操作步骤(步骤2.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有少量的RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤d。
d．按照等体积混合适当体积的样品裂解液B和无水乙醇，Vortex混匀。
每一个样品，需混合200微升样品裂解液B和200微升无水乙醇。如果有10个样品，则需混合2ml样品裂解液B和2ml无水乙醇，以此类推。配制好的样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液，室温放置，3个月内有效。必须Vortex充分混匀，否则会严重影响抽提效果。
e．最高速剧烈Vortex 15秒。加入400微升步骤d配制的样品裂解液B和无水乙醇等体积混合液，剧烈Vortex混匀。
加入样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内，沉淀不会影响抽提效果。
f．把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
g．加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
h．加入600微升洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
i．再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
j．将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-200微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在次用200微升洗脱液洗脱后，再用200微升洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10-80%，特别是当次洗脱下来的DNA大于10微克时，第二次洗脱可以获得次洗脱时50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
3. 从培养的动物细胞中抽提总DNA
a．收集最多不超过500万的细胞，离心沉淀后重悬于200微升PBS中。
PBS需自备。如果使用冻存的细胞沉淀，先把细胞沉淀解冻，并轻轻弹散，然后再加入PBS。对于基因组DNA含量较高的细胞，例如Hela细胞，应使用较少的细胞，例如100-200万Hela细胞。
b．清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。
在不做清除RNA的操作步骤(步骤3.b)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤c。
c．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。
d．加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。
e．加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。
加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
f．把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
g．加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
h．加入600微升洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
i．再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
j．将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-200微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在次用200微升洗脱液洗脱后，再用200微升洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10-80%，特别是当次洗脱下来的DNA大于10微克时，第二次洗脱可以获得次洗脱时50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
4. 从动物血液中抽提总DNA
本操作方法也适用于血沉棕黄层(buffy coat)和骨髓(bone marrow)的总DNA抽提。
a．取50-100微升红细胞无细胞核的血，或5-10微升活细胞有细胞核的血。
人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的红细胞无细胞核，鸟、鱼、蛙等的红细胞有细胞核。红细胞有细胞核会导致相同体积的血液内DNA的含量非常高。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入PBS至总体积为220微升，Vortex混匀。
d．加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
e．转步骤3.e。后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.e起的步骤。
5. 从石蜡包埋的组织样品中抽提总DNA
由于包埋的组织通常已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。乙醇或甲醛固定的石蜡包埋组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。需自备二甲苯。
a．取一块小于25mg的包埋块，加入1.2ml二甲苯，剧烈Vortex，以充分脱腊。
b．台式离心机最高速(12000-14000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
注意，去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
c．加入1.2ml无水乙醇，轻轻Vortex混匀，以去除残留的二甲苯。
d．台式离心机最高速(12000-14000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
注意，去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
e．重复步骤c和d一次，即再用乙醇洗涤样品一次。
f．弃上清后再最高速离心1分钟，用20微升枪小心吸除残留的液体。
g．室温放置数分钟至乙醇全部挥发。
h．加入180微升样品裂解液A。
i．转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
6. 从甲醛固定的组织中抽提总DNA
由于组织已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。甲醛或乙醇固定的组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。乙醇固定的组织可以参考甲醛固定的组织的抽提方法进行总DNA的抽提。
a．取不超过25mg的组织，用PBS洗涤两次，以充分去除固定液。
b．去除PBS，转步骤1.a，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.a起的步骤。
7. 从革兰氏阴性菌中抽提总DNA
a．离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
b．加入180微升样品裂解液A，充分重悬细菌。
c．转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
8. 从革兰氏阳性菌中抽提总DNA
需自备溶菌酶，并配制溶菌酶溶液：20mM Tris，pH8.0，2mM EDTA，1.2% Triton X-100，20mg/ml溶菌酶。溶菌酶在临使用前加入。
a．离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
b．用180微升溶菌酶溶液充分重悬细菌。
c．37℃孵育30分钟以裂解细菌。
d．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。
e．加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。
不可把蛋白酶K直接加入到样品裂解液B中。
f．70℃孵育30分钟。
g．转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。
9. 从酵母中抽提总DNA
需自备用于裂解酵母的酶lyticase，并配制酵母裂解液：1M 山梨糖醇(sorbitol)，100mM EDTA，14mM 
a．离心收集最多不超过50万个酵母，弃上清。
b．用600微升上述酵母裂解液重悬，加入200U lyticase，30℃孵育30分钟。
注意：裂解的时间会随酵母的种类不同而有所不同，详细情况请参考lyticase的说明书。
c．300g离心10分钟收集沉淀，弃上清。
d．沉淀用180微升样品裂解液A重悬。
e．转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
10. 从昆虫中抽提总DNA
a．用液氮冷冻后研碎处理：
a).取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)，液氮冷冻后研碎，转移至1.5ml离心管中。
b).加入180微升样品裂解液A。
c).转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
b．用匀浆器匀浆处理：
a).取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)。
b).加入180微升PBS，用电动匀浆器或玻璃匀浆器匀浆。
c).转步骤3.b，后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.b起的步骤。
11. 从其它样品中抽提总DNA
对于某些样品需使用特定的裂解液裂解，可以参考如下方法进行总DNA的抽提。
a．样品用200微升特定的裂解液裂解。裂解需确保呈溶液状态，如果有不溶物需通过离心沉淀去除。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入200微升样品裂解液B，立即Vortex混匀。
d．70℃孵育10分钟。
检查整个溶液的pH值，确保pH值小于7.0，否则DNA结合到纯化柱的效率会很低。
e．转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。