BeyoRT? II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)

BeyoRT™ II cDNA链合成试剂盒(RNase H-)

信裕生物生产的BeyoRT™ II cDNA链合成试剂盒(RNase H-)，即BeyoRT™II First Strand cDNA Synthesis Kit (RNase H minus)，是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)，用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA链合成所需的各种试剂。
使用本试剂盒合成的链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量
PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。
使用本试剂盒可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录(参考图1)，反转录的长度可以超过10 kb。在采用BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)的情况下，由于缺失了RNase H酶活性，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，这样反转录出来的cDNA的长度就会更长，并且产量更高。

图1. 使用本试剂盒对总RNA反转录后，对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见对于0.2-8kb的cDNA可以非常高效地被反转录。

本试剂盒中的BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)热稳定性高，最适反应温度为42-45℃，但当温度达到50℃时仍具有很高活性，且可获得较高产量的cDNA。
试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。
试剂盒还提供了Oligo(dT)₁₈和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA链的合成。
用于体积为20微升的cDNA链合成反应时，不同包装的本试剂盒足够分别进行20个，100个及500个cDNA链样品的合成。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
对于GC含量比较高的RNA的反转录，产品的使用说明中都给予了特别说明，请予以关注。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 
 

使用说明：
1. cDNA条链的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
a. 参考如下表格设置反转录反应(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可从碧云天订购)：

*To 12μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为12μl。
b. 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)₁₈或基因特异性引物，42℃孵育60 min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10 min，随后在42℃孵育60 min。
注意：对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA，可以50℃孵育60 min，以充分利用本产品中的反转录酶在50℃时仍有良好活性这一特点，在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
d. 80℃孵育10 min以失活BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。
说明：对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为 20和50微升，则推荐相应地使用0.8和2微升反转录产物。
2. 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。
常见问题：
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。 
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，能重新制备总RNA样品。
避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用碧云天的BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。 
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。 
e. 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)₁₈引物。使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。
f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45-50℃。