T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5'-P末端和3'-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA 连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。
用途：T4 DNA Ligase常用于DNA片段和载体、linker或adaptor等的连接。也可以用于缺刻修复及Ligase介导的RNA检测。
来源：本T4 DNA Ligase由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。
活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16℃ in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM (300 μg/ml)。200U等于1个Weiss unit，以Weiss unit计，本产品共200单位。
T4 DNA Ligase连接产物转化感受态后涂板LB平板的效果参考图1。

图1. 本T4 DNA Ligase的连接产物转化感受态细菌后涂板获得的LB平板效果图。A. 双酶切后的载体纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，满足常规连接反应要求。
酶储存溶液：20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50% (v/v) glycerol。
10X Ligation Buffer：400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP。
失活或抑制：65℃孵育10分钟可以导致T4 DNA Ligase失活；NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈抑制T4 DNA Ligase。

包装清单：

保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
对于普通的转化大肠杆菌的操作，不必对连接产物进行纯化，连接产物可以直接用于转化。但用电转方法转化大肠杆菌时，通常宜先用DNA纯化试剂盒或酚氯仿抽提方法等纯化DNA，然后再进行电转。
需进行平端连接或快速连接时，推荐使用信裕生物的快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase可以进行平端连接，但效率较低。
普通连接反应不必进行凝胶电泳观察。如果需要对于连接产物进行凝胶电泳观察，推荐先在65℃孵育10分钟使
T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA结合导致的条带位置迁移(band shift)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。则可以取连接过夜的剩余连接产物再次转化大肠杆菌。 
e. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
3. Linker或RNAi片段和载体的连接：
a. 载体的酶切和纯化同步骤1a和1b。
b. Linker或RNAi片段的退火可以选择适当的DNA退火缓冲液，例如信裕生物的
Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(D0251)， 进行退火反应。
c. 长度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和载体进行连接反应。例如载体为0.03pmol，则插入片
段可以为0.15至0.3pmol。长度小于8bp的linker，比例需调整为10:1以上。
d. 除插入片段的用量外，随后按照步骤1e-1h进行。
4. DNA自身环化的连接：
参考步骤1e，待插入片段换成适量的水即可。其余步骤按照步骤1f-1h进行。
5. 其它类型的DNA片段连接参考上述方法进行。

常见问题： 
1. 连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少：
a. 可能感受态细菌转化效率太低，用质粒作为阳性对照同时检测感受态的转化效率。
b. 可以尝试提高载体或插入片段的纯度。对于平端连接需注意适当延长连接时间。 
c. 可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照。 
d. 用存放DNA的溶液进行转化，作为阴性对照，检测感受态细菌是否存在问题。