T3 RNA Polymerase

T3 RNA Polymerase

T3 RNA Polymerase，即T3 RNA聚合酶，是一种高度特异识别T3启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。T3 RNA 
Polymerase可以催化单链或双链DNA T3启动子下游NTP的掺入，合成与T3启动子下游的模板DNA互补的RNA。
特点：T3 RNA Polymerase可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T3启动子有高度的特异性。
用途：用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定(RNase 
protection assay)，反义RNA合成，作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析，siRNA、miRNA等小RNA。
来源：由大肠杆菌表达，表达基因为嗜菌体T3 RNA Polymerase基因。
活性定义： 37℃60分钟内，催化1nmol AMP掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，6mM MgCl₂，10mM DTT，2mM spermidine，0.5mM NTP，
0.6MBq/ml[³H]-ATP，20μg/ml plasmid DNA containing the specific T3 RNA Polymerase promoter sequence。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶储存溶液：50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，5mM DTT，0.1mg/ml BSA，0.5mM Elugent，50% glycerol。
Transcription Buffer(5X)：200mM Tris-HCl(pH7.9 at 25℃)，30mM MgCl₂，50mM DTT，50mM NaCl，10mM 
spermidine。
失活或抑制：70℃加热10分钟可使T3 RNA Polymerase失活。加入适量EDTA也可以使T3 RNA Polymerase失活。螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制T3 RNA Polymerase的活性。
T3的consensus promotersequence如下：
-15  -10   -5   +1  +5
AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA
包装清单：

保存条件：
-20℃保存。
注意事项： 
酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. RNA合成：
a. DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
b. 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒，例如信裕生物的
DNA纯化试剂盒(D0033)，直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
c. 参考如下表格设置反应体系：

d. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
e. 37℃孵育1～2个小时。
f. 加入2μl 0.5M EDTA (pH 8.0)到反应体系中混匀或-20℃冷却终止反应。
g. 电泳分析转录产物，或通过其他适当方法鉴定转录的效率。
注意： 
a) 转录需在无RNA酶条件下进行。
b) 反应体系需在室温条件下配置，4℃有亚精胺(spermidine)存在时DNA可发生沉淀。
c) 按以上反应条件，每1μg 模板DNA可合成超过10μg 的RNA。
d) 如果模板DNA的线形化不太完全，会导致转录出比预期长度更长的RNA，同时使预期长度的转录本比例下降。
e) 可根据实际情况按照比例放大或缩小上述反应体系。
2. 放射标记RNA的合成：
a. DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
b. 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒，例如信裕生物的
DNA纯化试剂盒(D0033)，直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
c. 参考如下表格设置反应体系：

d. 37℃孵育1～2个小时。
e. -20℃冷却终止反应。
f. 分析和检测RNA的标记效率。
注意： 
a) 按以上方法合成的RNA活性一般为3-5 x10⁸dpm/μg。
b) 上述标记反应中也可以使用[³²P]、[³⁵S]或[³H]标记的其他NTP。使用其他放射性标记的NTP时，其他的NTP需作相应调整。20μl反应体系各成分推荐使用剂量分别为：1.85MBq(50μCi)5'-[α-³²P]-CTP,～30TBq/mmol(800Ci/mmol)；11.1MBq(300μCi)5'-[α-³⁵S]-UTP,>37TBq/mmol(>1000Ci/mmol)；0.925MBq(25μCi)5,6-[³H]-UTP,1.1-2.2TBq/mmol(30-60Ci/mmol)。
c) 放射性标记NTP浓度低于12μM时，全长转录本合成效率也会下降。
3. 其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。