放线菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒
Actinomyces spp
它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供病毒样品。
2. 根据放线菌属通用保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测,避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。
规格及成分
储存条件:-20℃以下,有效期12个月。
使用方法:
一、样品采集:
1、食品样品:样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验要求进行。
2、血液样品:用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL,注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管,立即混匀。
3、粪便样品:取粪便置于灭菌的收集管中送检。
4、病灶部位样品:取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
一、稀释 PCR 阳性对照(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)
1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
注:上述样品建议经过增菌后,收集培养物用于检测。
二、DNA提取:
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液,按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购上海泽叶生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品,并按照相应试剂盒说明进行操作。
1、液体培养物:取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中,8000rpm离心3min,尽量吸弃上清,加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
2、固体培养物:挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
3、粪便样品:挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中,加入0.5mL生理盐水,振荡混匀,13000rpm离心3分钟,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
4、其他液体标本:取标本2-3mL,13000rpm离心3min,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
注:阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取),直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高,建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
检测步骤:
三、设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
10. 如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个
样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复,则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
第 7 步所得 PCR 阳性对照稀释液(2-7 号)
各 6μL(2 号样到
2 号管,3 号样到 3
号管…)
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照,其他荧光PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,则用水替代。
盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
2.qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM
四、结果分析:
1.结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2.试验成立判定
1)阴性对照(NTC):不应产生任何的扩增曲线。
2)阳性对照(ESKZ -PTC):均产生扩增曲线,且Ct值≤35。
3)以上条件应同时满足,否则,此次试验视为无效。
3.结果判定
1)在试验成立的条件下,Ct值≤35的样本为阳性,表明阪崎肠杆菌核酸阳性。
2)Ct值显示为无的样本为阴性样本,表明阪崎肠杆菌核酸阴性。
3)如果35<Ct值≤40,判为可疑样品。对于可疑样品,先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线,则为可疑阳性,否则判为阴性。
4)对于可疑阳性样品,重新抽提核酸,再次进行阪崎肠杆菌real time PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线,判为样本阳性,表明阪崎肠杆菌核酸阳性;否则判为样本阴性。
五、注意事项:
1)初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
2)所有使用的离心管应高压灭菌,而且必须不含DNA酶。
3)PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等),防止实验室污染。
4)样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
5)试剂盒里所有物品应视为污染物对待,按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。