植物线粒体纯化试剂盒
产品及特点植物线粒体是重要的植物细胞器，负责 ATP 的产生。此外植物很多重要的特性(如 雄性不育)也跟线粒体相关，是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行生化和遗 传研究都需要进行线粒体纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体纯化的试剂盒， 它具有下列特点：
1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。
2. 提供粗提和精提两种操作方案，粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进 行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的 SDS-PAGE， Western，ELSIA 和蛋白组分析，也可以用于 PCR 级别的线粒体 DNA 和 RNA 提取。
3. 精提利用冷冻超速离心（离心力达 40000g）制备的密度梯度来将粗提制备的线 粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的偶联分析、 体 外 线 粒 体 蛋 白 合 成 、 线 粒 体 成 份 定 位 等 精 细 实 验 。 也 可 用 于 后 续 的 SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体 DNA 和 RNA 提取。
4. 本产品足够 5 次提取，每次可处理 10g 绿色植物组织（可得 1-2.5 mg 左右线粒 体）或 20g 非绿色植物组织（可得 2-5 mg 左右的线粒体）。
规格及成分 成 分 编号 大纸盒包装
匀浆液 LM111208A 250 mL
洗涤液 LM111208B 250 mL×2
离心介质溶液 111208C 150 mL
Percoll 17-0891-09 50 mL
BSA 干粉 9048-46-8 10g
带柄尼龙筛 --- 1 只
软毛笔 --- 1 只
使用手册 111208sc 1 份
运输及保存 常温运输和保存, 保存期限一年。
自备试剂 超纯水，可能需要 5 M KOH 调 pH，如果需要去除细胞核 DNA，还需要自备 25mM MgCl2溶液、0.5M EDTA 溶液、DNase 干粉和另购更多洗涤液。
使用方法 注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植 物组织，器皿和溶液均需要在 4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过 4℃。
一：选择组织
1. 植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：植物组织种类 线粒体产率 说明根和块茎 0.3 mg/10g 如土豆，红薯等黄化苗（下胚轴、子叶、胚芽鞘） 2-5 mg/10g 多酚含量低于叶片有光合作用的叶片和子叶 1-2.5 mg/10g 需放置在暗处 3 天
2. 一般纯化好选用用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少 3 天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3. 一次实验需要 40 mL 匀浆液、约 90 mL 洗涤液和 35 mL 密度梯度离心介质（配制方式是一次性将 9.8g (8.7mL) Percoll 加入到 26.3mL 离心介质溶液中，充分混匀后得到 35mL 密度梯度离心介质）。这三种溶液用前均需要加入 BSA 干粉使其终浓度为 0.1%（100mL 溶液加 0.1g BSA 干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用）。每次实验用多少配多少，不要预先将所有 BSA 干粉加入，否则容易长菌。
二：线粒体粗提操作流程
1. 将 10 g 的绿色植物组织（如去叶脉后的嫩叶子，愈伤组织）或 20 g 干净的非绿色植物组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中 10 分钟，用纸吸干液体后浸泡在预冷的 40 mL 匀浆液（需先加 0.1% BSA）中，在浸泡状态下剪成 1cm2大小的碎片。注意：如果样品可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集，否则线粒体产率将急剧降低。
2. 将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到 Waring 匀浆器中，中速匀浆 3 次，每次15 秒，每次之间间隔 10 秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也可使用研磨法。具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨 3-4 分钟。
注意：植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低 pH，而线粒体对 pH变化非常敏感，因此建议匀浆后用 pH 试纸检测匀浆液的 pH，如果低于 7.0，必须用自备的 5 M KOH 将 pH 调到 7.0 以上才进入下一步。
3. 用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的 50 mL 的塑料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
4. 在低速固定角度冷冻离心机上 4℃ 1000 g 离心 5 分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的 50mL 塑料离心管中。
5. 将装上清的离心管在水平冷冻离心机上 4℃ 12,000 g 离心 20 分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。
6. 加入 10 mL 预冷的洗涤液（需先加 0.1% BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果底下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。
7. 将线粒体重悬液转移到新的 50mL 离心管中，再加入 30mL 预冷的洗涤液（终体积为 40 mL）中，4℃ 1000 g 离心 5 分钟。线粒体将在上清中。
8. 将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中，4℃ 12000 g 离心 20 分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在 15-30%。
9. 在沉淀中加入 2 mL 预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多 4 管线粒体沉淀重悬在 2 mL 洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在 45-75%。
10. 所得线粒体粗提液含其他细胞器（如类囊体膜, 质体, 过氧化物酶体， 乙醛酸循环体,或细菌）污染，但可直接用于 PCR 级线粒体 DNA 和 RNA 的提取、呼吸链功能测定、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入 1/20 体积的自备 DMSO，混匀后分成 0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
三：细胞核 DNA 的去除（纯化测序级的线粒体 DNA 才需要进行此操作。本产品不
提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
11. 预留 50uL 线粒体粗提液做对照，在约 2 mL 剩余的线粒体粗提液中加入 40 uL25mM 的 MgC
l2，再加入 200ug DNase 干粉或溶液（总量为 200ug 即可），混匀后冰上放置 60 分钟降解 DNA。取
13. 4℃ 1000 g 离心 5 分钟，将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中，4℃ 12000g 离心 20 分钟，沉淀为去除细胞核 DNA 的线粒体。重悬在 2mL 洗涤液中。四：线粒体精提操作方案（需要 40000g 的超速冷冻离心机）
14. 在 50 mL 预冷的塑料离心管中先后加入 35 mL 预冷的密度梯度离心介质（配制
方法见第三步，用前需先加 0.1% BSA）。
15. 将 2 mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16. 在超速水平离心机上 4℃ 40,000 g 离心 45 分钟，最上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：
17. 用广口吸管（可将 1 mL 蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。
18. 在 15-20 分钟的时间内缓慢加入至少 4 倍体积的预冷的洗涤液。
19. 转入 50 mL 塑料管离心管中，在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心 20 分钟，沉淀为线粒体。
20. 将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少 4 倍体积的预冷的洗涤液中，在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心 20 分钟，弃上清，沉淀即为洗涤后的线粒体精提物。到此步时，线粒体回收率一般在 5-15%。
21. 将精提的线粒体重悬在 1mL 预冷的洗涤液中。重悬的线粒体可以立即使用，在冰上最多可放置 5-6 小时。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的 DMSO，混匀后分成 0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
五：线粒体后续处理（本产品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
22. DNA 提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的 SDS-蛋白酶 K 酶解，酚氯仿抽提，乙醇-盐沉淀的方法制备线粒体 DNA。也可以用细菌 DNA 提取的试剂盒制备DNA。
23. RNA 提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的 Trizol 方法制备线粒体 RNA。
24. 总蛋白提取：按细菌总蛋白提取方法。
25. 线粒体内膜，外膜、基质纯化：请自备方法。
26. 其他功能检测：请自备方法。
