动物线粒体纯化试剂盒

动物线粒体纯化试剂盒

产品及特点线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研 究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和生化研究都需要纯化线粒体。本产品可用于 纯化动物细胞线粒体的试剂盒。它具有下列特点：

1. 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。

2. 本试剂盒有粗提和精提两个操作选项，但是精提需要超速离心机。粗提所得线粒 体可以直接用于蛋白分析（SDS-PAGE、Western Blot、ELISA 等）、蛋白组分 析和线粒体 DNA 纯化。精提线粒体可以用于偶联分析和体外线粒体蛋白合成等 实验。

3. 本产品一次可以处理约 2×108个培养细胞，30 mg 培养细胞（相当于 15 瓶 150 mm 培养细胞）可以纯化到到 0.5-1.5 mg 线粒体。

4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不能用于动物实体组织。

5. 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。 
规格及成分 成份 编号 大扁纸盒包装
动物线粒体纯化溶液 A LM111207a 50 mL
动物线粒体纯化溶液 B LM111207b 250 mL×2
蔗糖 111207c 100 g（干粉瓶）
詹纳斯绿 B 染色液（0.2%） 111207d 1 mL（棕色管）
使用手册 111207sc 1 份

运输及保存 常温运输和保存, 保存期限一年。

自备试剂 PBS 缓冲液。 

使用方法注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的

溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。

一：准备工作（此步骤同柱式动物线粒体 DNAout 中线粒体提取步骤）。未用完的下

列溶液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前务必让沉淀溶解并摇晃均匀。

1. 将溶液 A 和溶液 B 放冰上预冷待用。

2. 配制 1.7M 高比重溶液（精提时需要配制此溶液，粗提时不需要配制此溶液）：

36 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 60mL，冰上预冷待用。

3. 配制 1.0M 低比重溶液。粗提时需要低比重溶液 100mL，配制方法是将 34 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 100mL，冰上预冷待用。精提时需要低比重溶液150mL，配制方法是将 51 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 150mL，冰上预冷待用。Dounce 匀浆器

4. 配制线粒体重悬液。粗提时需要重悬液 200mL，配制方法是将 150 mL 溶液 B

和 50 mL 1.0M 低比重溶液混合；精提时需要重悬液 300mL，配制方法是将 225

mL 溶液 B 和 75 mL 1.0M 低比重溶液混合，即得 300mL 线粒体重悬液，冰

上预冷待用。

二：线粒体粗提（此步骤同柱式动物线粒体 DNAout 中线粒体提取步骤）

5. 如果提取材料是单层细胞，先用 60 mL 自备的 PBS 缓冲液洗涤 2×108个培养

的单层细胞，共洗涤 2 次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在 60 mL PBS 缓冲

液中。如果是悬浮细胞，则 1000g 4℃离心 10 分钟收集 2×108个细胞，再用

60 mL PBS 缓冲液洗涤 2 次，后将细胞重悬在 60 mL PBS 缓冲液中。

6. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机 1000 g 4℃离心 10 分钟，吸弃

上清，保留细胞沉淀。

7. 加入 5 倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液 A，轻柔重悬细胞。

8. 冰上放置 4-5 分钟。注意：冰浴时间不要超过 5 分钟。

9. 如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置 20-30 分钟

后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。

10. 将细胞重悬液体转移到预冷的 Dounce 玻璃匀浆器中（工作体积为 10-15 mL，

间隙为 0.12 mm，好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。

细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要 40 次-60 次左右。匀浆是线粒体

纯化最关键的步骤，故匀浆前好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀

浆 5-10 次后，取 2-3 uL 匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整

细胞数量降低到 20%以下为佳。

11. 加入 1/3 体积的、预冷的 1.0 M 低比重溶液，轻柔混匀。

12. 用平甩转子离心机 4℃ 1000 g 离心 10 分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片

和细胞核，上清液含线粒体。

13. 转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。

具体做法是先滴 50uL 左右上清液到载玻片上，再滴入 50 uL 詹纳斯染液绿 B

染色液 20 分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

14. 用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机 4℃ 15000 g 离心 15 分钟，弃上

清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。

15. 用 10 mL 线粒体重悬液重悬线粒体，4℃ 15000 g 离心 15 分钟，弃上清。

16. 重复上步一次。

17. 后用适量的线粒体重悬液重悬线粒体，可用于各种后续实验（本试剂盒不提供

相关试剂），如果用于下面的精提操作，则用 10mL 线粒体重悬液重悬。

三：线粒体精提（需要超速离心机）

18. 在跟超速离心机匹配的 50 mL 的离心管中，加入 10 mL 预冷的高比重溶液，再

在上面加上 10 mL 预冷的低比重溶液，后再加上 10 mL 线粒体粗提液。

19. 70000g 4℃离心 40 分钟，线粒体将位于高比重溶液和低比重溶液之间区域。

20. 小心用广口吸管吸出线粒体到新的离心管中，加入等体积的线粒体重悬液。

21. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机 1000 g 4℃离心 10 分钟，吸弃

上清，保留线粒体沉淀。

22. 用 10 mL 线粒体重悬液重悬线粒体，在平甩转子离心机上 4℃ 1000 g 离心 10

分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。

23. 再重复上步一次。

24. 后用适量线粒体重悬液重悬线粒体，得到线粒体精提液。可以直接用于 Lowry

法蛋白浓度测定，也可以用于其他后续实验。