细菌膜蛋白质微量提取试剂盒

细菌膜蛋白质微量提取试剂盒

产品及特点本试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细 胞后，通过超速离心分离出细胞膜和附着的蛋白质。跟传统的密度梯度离心法和去 污剂法相比，本方法具有下列特点：

1. 一步式分离细胞膜和膜蛋白，密度梯度离心法简单快捷。

2. 膜蛋白纯度高，能够去除各种胞浆蛋白的污染，也能去除松散附着在细胞膜上 的蛋白，所得膜蛋白主要是整合蛋白。

3. 膜蛋白完整性好，主要是由于实际中有抑制蛋白酶成分。

4. 回收效率高，一般能得到相当于总蛋白量 6%的膜蛋白。

5. 可用于 E. coli，S. typhimurium，K. aerogens，P. aeruginosa，C. crescentus 等细菌。 
规格及成分 成 分 编 号 大扁盒包装
细菌细胞膜蛋白提取溶液 A LM100929a 125 mL
细菌细胞膜蛋白提取溶液 B LM100929b 25 mL
细菌细胞膜蛋白提取溶液 C LM100929c 250 mL
DNase I 干粉 131230 3.5 mg
使用手册 100929sc 1 份

运输及保存 常温运输和保存，但 DNase I 需要低温运输，-20℃保存。有效期一年。

自备试剂 膜蛋白溶解液（取决于后续实验。如果后续实验为 SDS-PAGE，则用 1× SDS-PAGE 上样液作为溶解液；如果用于 2D 电泳，则使用 1×等电点电泳上样 液作为溶解液）。 

使用方法

准备：一次使用本试剂盒时需要将所有 DNase I 干粉倒入溶液 B 中，轻柔颠倒 使 DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，好在一个月内完，否则 DNase 将逐渐失去活性。此外，好在实验前 1 小时将溶液 B 冰浴预冷。 

用法一：小量制备（主要用于上样量比较小的 SDS-PAGE 电泳等实验）

1、 收集 20-40 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。

2、 加入 2 mL 溶液 A，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液 A 中。

3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。 4、 加入 0.5 mL 溶液 B（必须已经提前加入了 DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌 重悬。注：如果细菌起始量没有 20-40 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。 重悬在溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。 

5、 用超声或 French Press 方法裂解细胞。如果用 French Press 方法，则需要 处理至少两次，每次的压力为 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不论用哪 种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌 裂解过程，直到 80%以上的细菌都裂解为止。

6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料离心管中 （如 Beckman Optima 台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。

7、 在上清（细菌裂解液）中加入 5 mL 预冷的溶液 C，轻柔颠倒混匀后冰浴放置 30-60 分钟。其间可以轻柔颠倒混匀 3-5 次。

8、 用 Bechman Optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以 使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。

9、 小心移弃上清，在沉淀中加入 0.2 mL 溶液 A，充分吹打混匀。

10、用 Beckman Optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可 以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。 11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自备的， 跟后续实验兼容的缓冲液（如 1×SDS-PAGE 上样液中，可从本公司购买）， 所得膜蛋白的浓度将在 1mg/mL 左右。

用法二：大量制备（主要用于上样量比较大的 2D 电泳等实验） 

1、 收集 200-400 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。

2、 加入 20 mL 溶液 A，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液 A 中。

3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。

4、 加入 5 mL 溶液 B（必须已经提前加入了 DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有 200-400 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。

5、 用超声或 French Press 方法裂解细胞。如果用 French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程，直到 80%以上的细菌都裂解为止。

6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中，弃沉淀（未破裂细胞）。

7、 在上清（细菌裂解液）中加入 50 mL 预冷的溶液 C，轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60 分钟。注：可以在大烧杯中装冰，然后将装有样品的小烧杯放入，在放

入干净的搅拌子，以低速度搅拌。

8、 用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。

9、 小心移弃上清，在沉淀中加入 2 mL 溶液 A，充分吹打混匀。

10、用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。

11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在 1 mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液（如 1×等电点电泳上样液，可从本公司购买），所得膜蛋白的浓度在 1mg/mL 左右。