酿酒酵母Y187感受态细胞

酿酒酵母Y187感受态细胞

产品及特点Y187 菌株是 Clontech 公司开发的 GAL4 系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型， 可直接转化质粒或与 MATa 型酵母菌株（Y2HGold，AH109 等）通过 mating 操作进行 筛库试验。Transformation marker 为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ, MEL1。Y187 -GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7 和 PGADT7。质粒 PGBKT7 的筛 选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD(来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸)与目 标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒 PGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4 系统原理：一个完整的酵母 转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域：位于 N 端 1~174 位氨基酸区段的 DNA 结合域（DNA-BD）和位于 C 端 768~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 能够识别 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并与之结合。而 AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现 完整的 GAL4 活性，使含有 UAS 的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与 AD 结合，将要检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey 发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互 接近，形成完整的 GAL4，从而激活报告基因的转录。
规格及成分 成分 编号 包装
Y187 感受态细胞 140389A 0.1 mL×10
PGADT7（control vector），10 ng/μL 140389B 10 μL
Carrier DNA，5 μg/μL 140389C 100 μL
PEG/liAC 140389D 5 mL
使用手册 1 份

运输及保存 感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/liAC、PGADT7 质粒 4℃保存；有效期半年。 

自备试剂 目的 DNA、YPDA、 SD 培养基等

使用方法

1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100μL，可以根据 实际情况分装使用。 以下实验以 100 μL 感受态细胞为例。

2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入预冷的目的质粒 2-5μg，Carrier DNA（95-100℃ 5 分钟，快速冰浴，重复一次）10μL，PEG/LiAc 500μL，吹打 混匀，30℃水浴 30 分钟（15 分钟时翻转 6-8 次混匀）。

3. 42℃水浴 15 分钟（7.5 分钟时翻转 6-8 次混匀）。

4. 5000 rpm 离心 40 秒，弃上清。取 400μL ddH2O 重悬沉淀，5000rpm 离心 30 秒，弃上清。

5. 取 50μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养 48-96 小时。

注意：

1. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢， 以转化涂板为例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培养可见直径 1mm 克隆；涂 SD 单缺平 板 29℃，48-60h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 双缺平板 29℃，60-80h 培养可 见直径 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板 29℃，80-90h 培养可见直径 1mm 克隆。

2. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平 板上的 Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利 用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P - ribosylamino imidazole（AIR） 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

Y187 有两个报告基因：lacZ, MEL1， 分别由两种不同的启动子（G1，M1）启动，这两种启动子只有 GAL4 识别的 17bp 核心 区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。 Y187感受态细胞是实验室常用酵母双杂用菌株，本产品经特殊工艺制作而成，经 PGADT7质粒检测转化效率为104 cfu/μg DNA。

菌株基因型如下：

MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1