酿酒酵母AH109化学感受态细胞

酿酒酵母AH109化学感受态细胞

产品及特点 AH109 菌株来源于 PJ69-2A 酵母菌株，将 lacZ 报告基因引入 PJ69-2A 诞生了 AH109，此菌株是 Clontech 公司开发的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可 直接转化质粒或与 MATα型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试 验。Transformation marker 为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1。 AH109-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD(来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸) 与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒 PGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。

GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构 域：位于 N 端 1 ~ 174 位氨基酸区段的 DNA 结合域（DNA-BD）和位于 C 端 768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 能够识别 GAL4-responsive gene 的上游激活 序列 UAS，并与之结合。而 AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在 不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的 GAL4 活性，使含有 UAS 的启动子下游基 因转录表达。正常条件下，BD 不与 AD 结合，将要检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合， 形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey 发 生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的 GAL4，从而激活报告基因 的转录。AH109 有四个报告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分别由三种不同的启动子 （GAL1，GAL2，MEL1）启动，这三种启动子只有 GAL4 识别的 17bp 核心区相同，其 余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。

本产品经特殊工艺制作而成，经PGADT7质粒检测转化效率为＞104 cfu/μg DNA。

菌株基因型如下：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
规格及成分 成分 编号 包装
AH109 感受态细胞 LM140386a 0.1 mL×10
PGADT7，10 ng/μL LM140386b 10 μL
Carrier DNA，5 μg/μL LM140386c 100 μL
PEG/LiAc LM140386d 5 mL
使用手册 LM140386sc 1 份

运输及保存 感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效 期半年。

自备试剂 目的 DNA、YPDA、 SD 培养基等

使用方法

1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100 μL，可以根据 实际情况分装使用。 以下实验以 100 μL 感受态细胞为例。

2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入 2-5 μg 预冷的目的质粒、10μL Carrier DNA（95-100℃ 5 分钟，快速冰浴，重复一次）、500 μL PEG/LiAc， 吹打混匀，30℃水浴 30 分钟（15 分钟时翻转 6-8 次混匀）。

3. 42℃水浴 15 分钟（7.5 分钟时翻转 6-8 次混匀）。

4. 5000 rpm 离心 40 秒，弃上清。取 400 μL ddH2O 重悬沉淀，5000 rpm 离心 30 秒，弃上清。

5. 取 50 μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养 48-96 小时。