可保种型蓝白T载体

可保种型蓝白T载体

产品及特点 本产品(曾用名:一站式蓝白 T 载体)是环状的可以制备蓝白 T 载体的质粒 DNA。T 载体是克隆 PCR 扩增产物的必不可少的工具，但是由于市场上的各种T 载体质量参差不齐，用户很难购买到满意的产品；同时购买的 T 载体为线性DNA，不能保种，必须反复购买，累计成本很高。为解决这一问题，基因特推出可保种型 T 载体，用户只需要购买 Xcm I 内切酶就可以自己制备高质量的 T载体，随用随配，十分方便。

1. 一次购买，终身拥有。本产品提供制备 T 载体用的环形质粒 DNA，可以象其他质粒一样保种并长期保存。

2. 随用随配，十分方便。用户只需要提供 Xcm I 限制性内切酶和基本分子生物学实验条件，就可以自己制备 T 载体。整个过程只要两天。

3. T 载体含 T 率为 100。本方法不是使用传统的加尾法，而是使用 Xcm I 酶切法。质粒的多克隆位点上预先插入了一段长为 1.3 Kb 的 Xcm I DNA 片段,经 Xcm I 酶切后回收得到的质粒 DNA（T 载体）两端自然全部带有 T 突出，

比例远远高于用 Taq DNA 聚合酶加尾法和 TdT 加尾法得到的 T 载体。

4. 方便各种下游操作。用本产品得到的蓝白 T 载体插入位点两侧有多种常见的酶切位点，便于后续克隆； Xcm I 位点在 Alpha 互补区，可以使用蓝白斑筛选重组子；两边还有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶启动子，便于制备 RNA 探针
规格及成分 成 份 编 号A 型塑料袋包装B 型塑料袋包装
蓝白 T 载体(环状) LM60803a 50 ng 50 ng
Xcm I (5U/uL) LM60803b 无 20 uL
Xcm I Buffer, 10X LM60803c 无 0.3 mL
使用手册 60803sc 1 份 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期两年

自备试剂 连接反应试剂

使用方法 一. 细菌的转化

1. 将100 μL感受态细胞于冰上解冻。注意：好使用end A1菌种（如DH1、

DH5、DH5?、JM109、XL1-Blue等。常用宿主细菌的基因型可以参考

《分子克隆手册》等参考书）。因为这类细菌所含DNase少，制备T载体后，残留的DNase对的T末端的破坏机会更小。

2. 取5-10 μL本产品加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。

3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热休克90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。

4. 每管中加900 μL LB培养基，37℃振荡培养1小时。

5. 取100 μL培养液涂布到含Amp的LB琼脂平板表面。

6. 将平板置于室温直至液体被吸收。

7. 倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。

二. 细菌的鉴定

1. 挑取单个菌落进行过夜细菌培养。

2. 按常规的方法进行质粒小量制备。

3. 用Xcm I内切酶按下面条件酶切提取的质粒DNA，如果大规模酶切，需要

按比例增加各成分用量:

成分 使用量

Xcm I Buffer, 10X 5 uL

质粒DNA <或= 2 ug

Xcm I 1 uL

超纯水 加到50uL

 37℃保温一小时, 65℃保温20分钟使酶失活。

4. 电泳，本产品被Xcm I酶切后将产生3 Kb和1.3 Kb的两段DNA。

5. 如果Xcm I酶切图谱正确，则按常规的方法进行细菌的保种（详见分子克隆手册等参考书）。

三. T载体的制备

1. 参考《分子克隆手册》等参考书培养细菌和提取质粒DNA。注意：一定要去尽可能去除残留的RNA和蛋白质（含残留DNase）的污染。

2. 用Xcm I酶切质粒。注意：酶切时间好不要超过一小时，避免残留的DNase对T末端的破坏。

3. 电泳后切下含3Kb DNA（既蓝白T载体）的胶段。注意：千万不要用UV照射将要回收的片段，因为UV会使DNA交连，使DNA失去转化细菌的能力。如果酶切的DNA量大，可以使用基因绿如蓝核酸染料,可以直接在可见光和黑背景下切胶。如果别无选择，好在长波（360nm）紫外灯下快速切胶，尽可能切掉多余的凝胶。为避免DNA交连，可以使用基因的DNA防护剂UV Erasol（CAT#：60601）

4. 用常规DNA回收方法进行胶回收。

5. 测定T载体DNA的浓度后，将T载体DNA保存在-20℃备用或直接使用。

四. 连接反应

1. 短暂离心装有T载体的离心管。

2. 在两个离心管中加入下列成分：

成份 样品管 阴性对照管

T4 Ligase Buffer，10X 1 uL 1 uL

蓝白 T 载体 20-50 ng 20-50 ng

PCR 纯化产物 50-500 ng 不加

T4 Ligase 3-5 U 3-5 U

补水到 10 uL 10 uL

注意: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比好为3:1-10:1。

3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后，16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的操作手册进行连接)。

五. 细菌转化和鉴定

1. 取5 μL连接产物进行转化，具体步骤见本手册一，好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板以便进行蓝白筛选。

2. 按经典的质粒提取+酶切或测序鉴定，可以选用的、在插入位点两侧都有酶切位点的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。按菌落PCR方法筛选，可选用基因的菌落PCR试剂盒（CAT#：50901）进行快速筛选，需要T7和SP6 RNA聚合酶启动子引物。