两管式RT-PCR试剂盒（MMLV-Taq）

两管式RT-PCR试剂盒（MMLV-Taq）

英文名称：
运输：低温
保存：负20℃
有效期：1年
货期：1-2天
其他：
产品介绍：
先cDNA合成，再qPCR

使用方法

1. 将 50-300mg 昆虫组织放入 10-15 mL 塑料离心管中，加入 1 mL 溶液 A，然后用匀浆器匀浆 5-20 秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎昆虫组织，砚磨完后加入 1 mL 溶液 A。注意：溶解溶液 A 沉淀。溶液 A 在 4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。

2. 将匀浆物或砚磨物转移至干净的 1.5 mL 塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。

3. 在离心管中加入 0.3 mL 的溶液 B 和 0.2 mL 自备氯仿，在振荡器上振荡30 秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

4. 室温 12,000 rmp 离心 3-5 分钟，两相间将有约 5-10 毫米厚的细胞破碎物。

5. 将上清液(约 0.6 mL)转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中，下层有机相和中间层含有 DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。好留下 100 uL上清液不取。

6. 加入等体积的溶液 C，充分颠倒混匀。

7. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12,000 rmp 室温离心半分钟，弃穿透液。

8. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中， 12,000 rmp 室温离心半分钟，弃穿透液。

9. 加 0.7 mL 通用洗柱液，室温 12,000 rmp 离心半分钟，弃穿透液。

10. 加 0.3 mL 通用洗柱液，室温 12,000 rmp 离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。

11. 室温 12,000 rmp 离心半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响 RNA的使用。

12. 将离心吸附柱转移到 RNase-free 收集管中，加入 50-100 uL RNA 洗脱液，室温放置 1-2 分钟。

13. 12,000 rmp 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

14. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。注意：大部分昆虫的 28S RNA 被切割成两个小的片段，彼此用氢键相连，所以在甲醛变性胶中，没有 28S带出现（文献见：Eva C. Winnebeck，Craig D. Millar and Guy R. Warman，Why does insect RNA look degraded Journal of InsectScience: Vol. 10：1-7）

15. RNA 产量产率测定：将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在 OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。

16. RNA 纯度测定：无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。