即用型易错PCR试剂盒

即用型易错PCR试剂盒

产品特点：制突变PCR易错 PCR（error-prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的 dNTP 浓度、Mg 浓度和 MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。易错 PCR 和常规 PCR 的比较如下：本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错 PCR 而开发，本产品具有下列特点：

1. 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。

2. 配方经过精心优化，突变率稳定，突变没有趋向性。易错 PCR 的突变率为 0.66%（±0.13%），详见使用手册疑难解答。

3. 比体内基因突变更快捷简单，但如果在 PCR 引物中设计位点，则可使产物克隆到表达载体，也可以用于体内蛋白活性的筛选。

4. 可用于连续易错 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。

5. 只适用于扩增 1kb 以下的产物，对于 1kb 以上的产物，建议分段扩增。

6. 本产品足够 100 次 30uL 体系的易错 PCR 反应，只能用于科研。
规格及成分 成 份 编 号 十孔盒包装
易错 PCR Mix，10× LM101005a 300 uL（白盖）
易错 PCR 专用 dNTP，10× LM101005b 300 uL（绿盖）
易错 PCR 专用 MnCl2 LM160903c 300 uL（黄盖）
易错 PCR 专用
Taq DNA 聚合酶（5U/uL）
101005c 50 uL（红盖）
使用手册 101005sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。 

自备试剂 引物、DNA 模板、超纯水。

使用方法 1. 将自备的 PCR 引物稀释到 10uM。引物也是决定易错 PCR 成败的关键因素，设计引物时要保证其 Tm 在 70℃，长度在 25-30nt 之间，GC 含量在 45%-60%之间，3端 GC 含量低，并且没有发夹结构。用自备引物和常规 PCR 试剂扩增制备易错 DNA 模板（常规 PCR 产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错 PCR 的模板一定要用胶回收的常规 PCR 产物，因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错 PCR引物扩增所得，在易错 PCR 扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。如果常规 PCR 制备模板的引物和易错 PCR 引物不同（类似巢式 PCR）则可以避免此问题，但需要合成两对引物。本试剂盒只适用于扩增 1kb 以下的产物，对于1kb 以上的产物，建议分段扩增。

2. 将回收的 DNA 片段（模板）稀释到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三个浓度。

注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，模板 DNA 为非突变 DNA，扩增产生的 DNA 为突变 DNA，易错 PCR 体系最终 DNA 量是基本固定的，因此模板 DNA 使用量越大，则突变 DNA 在终产物中的相对比例就越低，突变率就越低。反之亦然。但模板太少又不容易扩增成功，所以建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的 PCR 产物进行分析。

3. 以 30 uL 的标准 PCR 反应体系为例，如果反应体系不是 30 uL，各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的 PCR 管中，加入下列成分：成分 模板用量 1 模板用量 2 模板用量 3

易错 PCR Mix, 10× 3 uL 3 uL 3 uL

自备 DNA 模板 1 uL（1ng/uL）1 uL（10ng/uL）1 uL（100ng/uL）

易错 PCR 专用 dNTP,10×3 uL 3 uL 3 uL

易错 PCR 专用 MnCl2 3 uL 3 uL 3 uL自备易错 PCR 引物(10 uM each)各 1 uL 各 1 uL 各 1 uL

易错 PCR 专用 Taq

DNA 聚合酶（5U/uL）

0.5 uL 0.5 uL 0.5 uL

补自备超纯水到 30 uL 30 uL 30 uL

4. 按用户已经优化的 PCR 条件进行一定循环数的 PCR（循环数与突变率的关系见下表），然后取 10uL 电泳检查。如果没有优化的 PCR 条件，一般可以先尝试下面的PCR 条件(注意：易错 PCR 一般不需要热启动，也不需要在 PCR 结束后做延伸处理)：

步骤 参数 循环数

PCR 前变性 94℃ 3 分钟 循环 1 次

易错 PCR

94℃ 1 分钟

45℃ 1 分钟 循环 30-60 次

72℃ 1 分钟

注：易错 PCR 一般不需要热启动，也不需要在易错 PCR 结束后做延伸处理。易错 PCR

循环次数越多，突变 DNA（扩增产物）与非突变 DNA（原始模板）的比例就越高。此外

在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的数就越高，在同一模

板上发生的突变位点数就越多，所以如果需要，可以做 30、35、40、45、50、55、60

次 7 个循环数的比较。

5. 电泳检测是否得到预计长度的 PCR 产物。如果没有，可以调整模板用量和 PCR 参数。

6. 胶回收易错 PCR 扩增产物、克隆并对单菌落进行功能筛选或测序分析、如果需要增加突变率，可以以突变后的 DNA 为模板，进行下一轮易错 PCR。