中pH缓冲液套装
产品及特点非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)是目前电泳法分离活性蛋白的 主要方法之一,跟 SDS-PAGE 根据分子量大小分离蛋白质不同,它主要根 据蛋白质的 pI 分离蛋白质。由于蛋白质的 pI 各不相同,所以对不同靶蛋白 质需要选用具有不同 pH 的电泳体系。单独配制不同 pH 的 Native PAGE 电 泳胶十分繁琐,为此本公司开发了本产品。它有下列特点:
1. 即开即用,用户不需单独准备各种成分,十分方便。
2. 非变性,电泳过程中蛋白质保持天然的构象和亚基之间的相互作用,得到 的蛋白质一般都具有生物活性(而 SDS-PAGE 得到的蛋白没有活性)。
3. 可以用于分析蛋白质和 DNA 或 RNA 的相互作用、蛋白修饰、蛋白构型 改变、回收有活性蛋白质等试验。
4. 电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交等实验。
5. 提供具有3种不同pH的缓冲液套装,便于客户选择最适合的缓冲液体系。
中pH缓冲液套装
规格及成分成 份 编 号 大纸盒包装
丙烯酰胺干粉 100864 60 g(250mL 棕色塑料瓶)
甲叉双丙烯酰胺干粉 100877 3 g
TEMED 100880 1.5 mL(棕色管)
过硫酸铵干粉 100879 1 g(本色盖)
高中低缓冲液套装选一 ABC 之一(见下)
使用手册 81212sc 1 份
高 pH 缓冲液套装(编号 100828,只有 81212A-30 有此成分)
高 pH 浓缩胶配胶液(pH 6.7),4× 100828a 100 mL
高 pH 分离胶配胶液(pH 8.9),4× 100828b 200 mL
高 pH 电泳液(pH 8.3) 100828c 10 L(干粉)
高 pH 上样液,5× 100828d 1 mL
中 pH 缓冲液套装(编号 100829,只有 81212B-30 有此成分)
中 pH 浓缩胶配胶液(pH 5.5),4× 100829a 100 mL
中 pH 分离胶配胶液(pH 7.5),4× 100829b 200 mL
中 pH 电泳液(pH 7.0)干粉 A 100829c 55.2g
中 pH 电泳液(pH 7.0)干粉 B 100829d 10g
中 pH 上样液,5× 100829e 1 mL
低 pH 缓冲液套装(编号 100830,只有 81212C-30 有此成分)
低 pH 浓缩胶配胶液(pH 6.7),4× 100830a 100 mL
低 pH 分离胶配胶液(pH 4.3),4× 100830b 200 mL
低 pH 电泳液(pH 4.5) 100830c 10 L(干粉)
低 pH 上样液,5× 100830d 1 mL
中pH缓冲液套装运输及保存 常温运输和保存,上样液需低温运输、-20℃保存,保存期为一年。
自备试剂 去离子水、天然 PAGE 蛋白质标准或蛋白质等电电泳标准品
使用方法 特别说明:如何选择缓冲液高、中低 pH 缓冲液套装一定要配套使用。选择适当 pH 的缓冲液(包括上样液,电泳液,配胶液等)对蛋白质非变性 PAGE 非常重要,此又跟靶蛋白质的 pI 值密切相关。如果缓冲液的 pH 远离靶蛋白的 pI,则蛋白质分子带
电多(电荷密度大),电泳速度快,分辨率高。但过酸过碱又容易使蛋白质结构变性,失去活性,所以 pH 条件就是在电泳分辨率和维持活性之间寻找平衡,需要针对每种蛋白质进行摸索或通过滴定曲线来确定,没有通用的电泳缓冲体系。由于有近半数的蛋白质 pI 在 4-6.5,所以在不知道靶蛋白的 pI 时,可以先选用高 pH 缓冲系统。
一:配制分离胶
1. 确定浓度。对分子量在 100Kd 以上的蛋白质,可选用 3-5%的胶;对分子量在 20-150KD 之间的蛋白质,可选用 5-10%的胶;对分子量在10-80KD 之间的蛋白质,可选用 10-15%的胶。对未知样品,建议使用7.5%的胶。
2. 配制 10%的 APS(过硫酸铵):按每 0.1 克过硫酸铵干粉加 1 mL 去离子水的比例配制 10%的 APS 溶液,该溶液可以在 4℃存放一周。
3. 配制 30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(19:1)溶液:在本产品提供的装有60 克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入 146 mL 自备的去离子水和 3g 甲叉双丙烯酰胺,充分摇晃直到溶解(约需 10-20 分钟)即得 200 mL 30%丙烯酰胺(19:1)溶液。此溶液在一个月内用完,必须 4℃避光保存。
4. 配 10 mL 分离胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量): 在一个25 mL 的三角瓶中,先加入 4.2 mL 去离子水、3.3 mL 30%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(19:1)溶液和2.5 mL 4×分离胶配胶液。
5. 摇晃混匀后抽真空 10-15 分钟以去除溶液中的氧气(氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应,不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应)。
6. 加入 50uL 新配制的 10%APS 和 10uL TEMED(这是配制 10 mL 胶的用量,配制更大体积的胶则按比例增加),迅速摇匀后倒胶。注意:如果购买的是低 pH 缓冲系统,由于在低 pH 缓冲液中 PAGE 聚合速度降低,
所以需要加倍上述两成分的用量。
7. 在胶面距离顶部 1-1.5 cm 的时候停止灌胶。然后覆盖一层 1-5 mm 厚的水,使胶顶部液面平整。由于比重不同,水和丙烯酰胺溶液不会混合。
8. 室温聚合 30-60 分钟后,用 1×分离胶配胶液洗涤凝固的胶的顶部,待用。
二:配制浓缩胶(浓缩胶可以提高分辨率,适合于成分复杂的样品,一般使用浓度为 4%。使用浓缩胶时蛋白质泳动速度主要跟其尺寸和形状相关。因浓缩胶 pH 跟分离胶 pH 不同,蛋白质可能会发生聚合和沉淀。对成分单一的样品,可以不用浓缩胶,此时蛋白的泳动速度主要跟其电荷密度,尺寸和形状相关。)
1. 配 10 mL 浓缩胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量): 在一个25 mL 的三角瓶中,先加入 6.2 mL 去离子水、1.3 mL 30%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(19:1)溶液和2.5mL 4×浓缩配胶液。
2. 摇晃混匀后抽真空 10-15 分钟以去除溶液中的氧气(氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应,不去除将影响丙烯酰胺聚合反应)。
3. 按上表用量加入 50uL 10%APS 和 15uL TEMED(这是配制 10 mL 胶的用量,配制更大体积的胶则用量需按比例增加),迅速摇匀后在已经凝固的分离胶上倒胶。
4. 在液面达到顶部时停止灌胶,插入梳子。
5. 室温聚合 30-60 分钟,拔出梳子,用 1×电泳液冲洗加样孔。
三:电泳
1. 将凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽加入足够 1×电泳液。注:本产品提供 10 升电泳液,对低和高 pH 电泳液,用前需将所有干粉溶解在1 L 水中得 10×电泳液,可以室温放置,用时再稀释成 1×电泳液。一般不需要再调节 pH,但保险起见,可以用 pH 试纸测试一下 1×电泳液。低和高 pH 电泳缓冲液的 pH 分别是 4.5 和 8.3。对中 pH 电泳液,其干粉只能配 1×电泳液,否则不溶解。配制时称取中 pH 电泳液(pH 7.0)
干粉 A, 5.52g, 中 pH 电泳液(pH 7.0)干粉 B 1g 混匀,加去离子水至彻底溶解,调 pH 到 7.0,定容至 1L。客户根据可实际需要量按比例增减。
2. 连接电极。如果浓缩胶和分离胶的 pH 高于靶蛋白 pI,靶蛋白将带负电荷并向阳极移动,可以按标准的 SDS-PAGE 方法接通电极(上阴极下阳极);如果浓缩胶和分离胶pH低于靶蛋白pI,靶蛋白将带正电荷并向阴级移动,此时应该下阴极上阳极。
3. 300V 预电泳直到电流不再降低(约需要 30 分钟)以去除残留过硫酸铵。
4. 换电泳液。
5. 在液体蛋白质样品中加入 5×上样液(16 uL 液体样品加 4uL 上样液)后上样。0.75 mm 厚的胶可以上 10 uL,1.5 mm 厚的胶可以上 20 uL。在未用加样孔中也要加 1×上样液以防有样品的空道的样品扩散。注意:如果用考染检测,每个孔的蛋白在 50-100 ug 总蛋白,如果银染则只需要 1ug 即可。样品如果是蛋白质沉淀,可用 1×上样液直接溶解蛋白质沉淀后再上样。蛋白质溶液或沉淀中不能含有能够改变上样液 pH 的残留成分(如蛋白质沉淀剂 TCA),用前用 pH 试纸测试一下,不在上样液的 pH 范围时就用酸或碱调到正常范围。大量样品可用透析法调 pH。
6. 上样自备的天然 PAGE 蛋白质标准或等电电泳的标准品(如果有的话)。
7. 用 15 mA(对 0.75 mm 厚的胶)或 30 mM(对 1.5mm 厚的胶)的电流电泳直到染料移动到分离胶底部。微型胶一般需要 1-2 小时。注意:电
泳过程在冷室或有冷却系统,以免电泳产热使蛋白质变性。
8. 终止电泳,取出凝胶进行后续的实验处理(如染色或酶活性检测)。