一站式GST标记蛋白质微量纯化套装

一站式GST标记蛋白质微量纯化套装
产品及特点重组蛋白 N 端的 GST 谷胱甘肽 S 转移酶（Glutathione S Transferase） 能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层 析是利用 GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽 洗脱的特点而建立，是目前分离纯化 GST 标记蛋白质的重要方法。本产品就是 专门用于上述目的，具有下列特点：

1. 一站式套装，含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达 GST 标记蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。

2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达 95%的 GST-标记蛋白。

3. 只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的 GST 标记蛋白。

4. 每次可以处理 20 mL 的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。

5. 提供 4 mL 浓度为 50%的谷胱甘肽-Agarose 介质，可吸附 5-10 mg GST 标记蛋白质。

6. 本介质可以反复使用多次。
规格及成分 成份 编号 小扁盒包装 保存
谷胱甘肽-琼脂糖介质，50% 120101 4 mL 2-8℃
10×PBS 缓冲液 100215 100 mL 常温
GST 标签蛋白纯化溶液 A 111116a 1 mL 常温
GST 洗脱缓冲液成分一 111116b1 25 mL 常温
GST 洗脱缓冲液成分二 111116b2 80 mg 常温
溶菌酶（20 KU/mg） 100406 30 mg -20℃
Benzonase（1U/uL） 101001 100 uL -20℃
PMSF（10 mg/mL） 100853 1 mL -20℃
6 mL 层析柱(带筛板) 110809 1 套 常温
使用手册 111116sc 1 份 常温

运输及保存 常温运输和保存，谷胱甘肽-琼脂糖介质需常温运输 4℃保存，溶菌酶Benzonase 和 PMSF 需低温运输，-20℃保存。有效期一年

自备试剂 超纯水

使用方法 一:重组蛋白的表达和细菌收集

1. 37℃振荡培养 20 mL 含表达质粒的细菌到 OD600=0.6-0.8。

2. 加 IPTG 到终浓度为 0.1 mM，30℃振荡培养 3 小时或 22℃振荡培养 8 小

时（或过夜）。

3. 4℃ 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL 表达菌液，弃上清。

4. 用 1×PBS 缓冲液重悬细菌沉淀，4℃ 5000 g 离心 10 分钟，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。1×PBS 缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供的 10×PBS 缓冲液而得。PBS 缓冲液极其容易长细菌，注意防止污染。

二：细胞裂解

5. 如果用超声波破碎细胞，先用 1 mL 冰浴的新鲜配制的细胞裂解液重悬细菌沉淀（细胞裂解液的配制方法：在 1 mL 1×PBS 缓冲液中加入 50 uL 溶液

A 和 50 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液，混匀即可）。冰上超声裂解重悬菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，一般选 1K-10K 频率处理 15 次，每次 20 秒，间隔 1 分钟（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞层析柱。

6. 如果用酶法破裂细胞，则在 1 mL 冰浴的、新鲜配制的细胞裂解液重悬细菌（细胞裂解液配制方法：在 1 mL 1×PBS 缓冲液中加入 1.5 mg 溶菌酶干粉、50 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液和 5 uL Benzonase 溶液，混匀即可）。

将重悬细菌冰上放置 30 分钟，得到细菌裂解物。

7. 将超声或酶法得到的细胞裂解物在 13000 g 4℃离心 10 分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性 GST 标记蛋白。预留少量（如 100uL）作为裂解液留样，其余用于第 10 步的过柱。

三：层析柱的制备和 GST 蛋白纯化

8. 摇晃将 4mL 谷胱甘肽-琼脂糖介质充分混匀后，全部加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质的最低用量需要根据 GST 蛋白产量决定，100 mL 菌液最少需要使用 200 uL 介质。此处加 2mL 则绰绰有余）。下列步骤各溶液的用量均针对 4mL 介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。

9. 用 40 mL 预冷的 1×PBS 缓冲液洗柱。

10.将第 7 步得到的上清液（含可溶性 GST 标记蛋白）上柱，让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 电泳。GST 和谷胱甘肽之间的结合很缓慢，所以流速一定不能快，否则结合不充分。流速一般在 0.2-1mL/分钟即可。如要提高 GST 标记蛋白与介质的结合效率，可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在 4℃结合 30分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。

11.用 10 mL 1×PBS 缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）并预留100uL 作为穿透液留样，其余在确认实验成功后再丢弃。

12.用 0.2-0.5 mL GST 洗脱液洗柱，收集并保存穿透液，此穿透液即纯化的GST 标记蛋白样品。GST 洗脱液的配制方法是将约 80mg GST 洗脱液成分二干粉全部加入到 GST 洗脱液成分一溶液中，摇晃直到干粉全部溶解即得GST 洗脱液，分装成小份放-20℃保存，每次用一管。由于它可能含蛋白酶污染，所以纯化样品不能在 4℃长期放置，需留 100uL 左右用于后续浓度测定或/和 SDS-PAGE 电泳，其余放-80℃长期放置。

13.用裂解液留样（第 7 步）、穿透液留样（第 11 步）和纯化样品留样（第 12步）进行蛋白定量或/和 SDS-PAGE 分析。注意：本操作没有预先脱盐，故只能用 Bradford 法或 OD 检测法测定裂解液留样、穿透液留样和样品留样的蛋白浓度。按 OD 检测法，1 OD280 约等于 0.5 mg/mL 蛋白。由于

GST 的分子量为 26 KD，所以在 SDS-PAGE 胶上，GST 标记蛋白将比天

然蛋白大 26 KD。

附：GST 柱的恢复（本试剂盒不含所需试剂）

1. 用 3 倍介质体积的 6 M 盐酸胍处理柱子 10 分钟。介质为 2mL 则用 6mL，下同。

2. 用 3 倍介质体积的超纯水处理柱子 10 分钟。

3. 用 3 倍介质体积的缓冲液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）处理柱子 10 分钟。

4. 用 3 倍介质体积的缓冲液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）处理柱子 10 分钟。

5. 再重复 3-4 步两次。

6. 用 3 倍介质体积的超纯水处理柱子 3 次。

7. 若需要立即使用，则用 3 倍介质体积的 1×PBS 缓冲液处理柱子 2 次。堵上漏口，加 3 倍介质体积的 1×PBS 缓冲液洗涤后立即使用。

8. 若长时间不用，则上步的 1×PBS 改成 20%的乙醇，其余操作完全相同。