BCA法蛋白定量试剂盒
产品及特点本产品是基于 BCA 法(bicinchoninic acid,二奎啉甲酸法)蛋白检测原理开发的蛋白质浓度测定产品,BCA 法跟 Lowry 法的步完全相同,就是在碱性条件下,蓝色的 Cu2+被蛋白质还原成紫色的 Cu+。此反应类似 Cu2+与 Biuret(NH2-CO-NH-CO-NH2,双缩尿)发生的反应,故又叫 Biuret 反应(Biuret反应本省就可以测定蛋白质浓度,目前仍然是医院血液蛋白定量的方法)。第二步,Cu+与 BCA 发生反应形成水溶性的紫色化合物,通过分光在 562 nm 处测定紫色化合物的量就可以精确定量蛋白质浓度。BCA 检测灵敏度比 Biuret 反应高 100 倍左右。步Biuret 反应第二步BCA 反应此方法的特点如下。
1. 对各种常见的去污剂不敏感,但对 Cu 的还原剂和螯合剂比较敏感。
2. 比 Lowry 法更加简单快捷,45 分钟内完成测定。
3. 试剂稳定,室温可以放置两年。工作液 1 天内有效。
4. 线性范围在 20~2000 µg/mL。如果需要范围在 0.1-10ug/mL,需要选用超敏 BCA。
5. 最小测量体积为 1-20 uL。
6. 终产物稳定,变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
7. 可以检测最短到双肽,而 Bradford 法需要一定大小的蛋白质。
8. 有常规(试管)和微量(96 孔板)两种检测模式。
BCA法蛋白定量试剂盒运输及保存 常温运输和保存,但 BSA 标准品需要低温运输,-20℃保存,有效期两年。
自备试剂 样品缓冲液
使用方法 一:96 板操作模式
1、 取一块 96 孔板,先进行编号(编号可以根据样品数增加),并按照下表加入
BSA 标准,待测样品和溶解待测样品的缓冲液(可以用水替代):
编号BSA 标准(2ug/μL)待测样品(μL)样品缓冲液(μL)总体积(μL)蛋白含量(μg)0 0 0 20 20 01 1 0 19 20 2.02 2 0 18 20 4.03 4 0 16 20 8.04 8 0 12 20 16.05 12 0 8 20 24.06 16 0 4 20 32.07 20 0 0 20 40.0样品 1 0 X 补到 20 20 未知样品 N 0 Y 补到 20 20 未知
2、 计算 BCA 工作液需要量:根据样品数量(包括制备标准曲线的样品的数量)和每个样品需要 0.2 mL BCA 工作液的比例,计算所需 BCA 工作液的用量,然后加上 10%损耗作为实际需要配制的量。例如:计算出需要 5mL 工作液,实际按不少于 5.5 mL 的量配制。
3、 配制 BCA 工作液:按 50 体积溶液 A 加 1 体积溶液 B(50:1)的比例将二者充分混合,所得溶液即 BCA 工作液。比如:5 ml 溶液 A + 100 µl 溶液
B。注意:取用溶液 A 和溶液 B 前需要充分摇匀,溶液 B 非常容易形成沉淀,需要 65℃加热溶解后才能使用。当把溶液 B 刚加入到溶液 A 中时,最初会出现淡绿色沉淀,轻微晃动沉淀即会消失,工作液最后成绿色,可以室温放置 12 天,但需要将容器的盖子拧紧。
4、 将 10 倍体积(20μL 的 10 倍体积即 0.2 mL)的 BCA 工作液加入到各孔中并混匀。也可把 96 孔板放在振荡器上振荡 30 秒混匀。
5、 37℃放置 30 分钟。
6、 冷至室温,10 分钟内完成后续测定,否则化学反应还在继续进行,使光吸收值慢慢升高,每 10 分钟会升高 2.5%左右。
7、 在 562 nm 下比色测定样品的光吸收。如酶标仪没有 562 nm 的设定,可用接近的波长检测,如 570 nm。
8、 将编号为 0 号的样品(对照)的读数从其余所有样品(包括 0 号样品,其读数变成零)中扣除。
9、 以 0-7 号样品的 BSA 含量(μg,见上表最右行)为横坐标,以样品的吸光值为纵坐标,绘出 BSA 的标准曲线。
10、再将待测样品的吸光值(减去 0 号样品的读数后的值)标在标准曲线上,其在横坐标上对应的蛋白含量(μg)就是待测样品中的蛋白质含量,除以样品稀释液总体积(20 μL),乘以样品稀释倍数即为样品浓度(μg/μL)。
二:试管测定模式
1、 基本操作同上,只是操作改在编号的玻璃试管中进行,同时 BSA 标准品(2ug/uL)的使用量从低到高改为 0、5、10、20、40、60、80、100uL,样品的总体积从 20uL 改为 100uL,BCA 工作液的用量从每个样品 0.2 mL改为 2 mL。
三:注意事项
1、 BCA 法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。所以,如果蛋白质浓度较低,可以改在 60℃孵育 30分钟或更长。
2、 待测样品浓度在 20~2000 微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。
3、 在一定浓度范围内 BCA 法测定蛋白浓度不受下列化学物质的影响:
名称 在此浓度下不受影响
Ammonium Sulfate 1.5 M
Brij-35 5.0%
CHAPS 5.0%
EDTA 10 mM
Hepes 100 mM
Glycine, pH 2.8 100 mM
Guanidine HCl 4.0 M
Tween 20、60、80 5.0%
SDS 5.0%
Sodium Acetate pH 5.5 200 mM
Sodium Chloride (NaCl) 1.0 M
Sucrose 40%
Sodium Hydroxide (NaOH) 0.1 M
NP-40 5.0%
Triton X-100 5.0%
Urea 3.0 M
4、 本方法受样品中螯合剂和还原剂的影响,所以需确保 EDTA 浓度不高于10mM,二硫苏糖醇不高于 1mM,β-巯基乙醇不高于 1mM,没有任何EGTA,否则建议使用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒(CAT#:80815)。