随机引物法DNA探针标记试剂盒

随机引物法DNA探针标记试剂盒

产品及特点本产品是基于 Feinberg 和 Vogelstein 发明的随机引物标记法而开发出来的即用型 DNA 探针标记试剂盒，标记过程由双链 DNA 热变性、随机引物与单链 DNA 结合、在 Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探针并掺入标记的核苷酸三步组成， 可用下面的示意图表示： 本产品对 Feinberg 和 Vogelstein 经典方法进行了改良，具有下列特点：

1. 提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了 标记反应的可重复性。

2. 使用无外切活性的 Klenow exo- DNA 聚合酶，已标记 DNA 探针不会被酶降解。

3. 快速，最快 1 小时即可完成标记反应。

4. 得到的 DNA 探针比活性高（如果是同位素，可以达到 109cpm/ug DNA）。

5. 所需模版 DNA 量少，可以是各种形状（线状和环状）的、也可以是单链或双链的， 但长度必须在 100 bp 以上。

6. 得到的探针长度在 200-400 nt 之间，可以用于 Southern 杂交、Northern 杂交、 原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。

7. 提供三种标记选择，其中 90603A 可用于各种同位素和非同位素标记，但需自备标 记底物；90603B 和 90603C 可分别用于生物素和地高辛标记，不需自备标记底物。
规格及成分 A 型成 份 编 号 十孔盒包装
2×随机引物标记反应液(A 型) 90603a 50 uL
dATP，2 mM 90603d1 10 uL
dTTP，2 mM 90603d2 10 uL
dGTP，2 mM 90603d3 10 uL
dCTP，2 mM 90603d4 10 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 90603sc 1 份
B 型（生物素标记）
成 份 编 号 十孔盒包装包装
2×随机引物标记反应液(B 型) 90603b 50 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 90603sc 1 份
C 型（DIG 标记）
成 份 编 号 十孔盒包装包装
2×随机引物标记反应液(C 型) 90603c 50 uL
Klenow exo-聚合酶，2U/uL 90603e 5 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 90603sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 0.5M EDTA（pH8.0）。如果是 A 型，则需要自备标记的核苷酸。

使用方法

1. 在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分： 成分 用量 模板 DNA 50-150 ng 2×随机引物标记反应液(ABC 三种之一) 10 uL 超纯水 补水到 15 uL 注意：非同位素标记基团疏水性强，易与塑料离心管表面非特异性结合，所以要硅化 塑料离心管。模板 DNA 并非越多越好，否则会竞争性地抑制探针跟靶分子的杂交。

2. 沸水浴 5-10 分钟，或在 PCR 仪上 100℃加热 5-10 分钟后立即放冰上待用。

3. 高速离心数秒使所有液体集中在管底，根据试剂盒类型加入下列成份： 试剂盒类型 成分及用量 A 型 dATP、dGTP、dCTP 各 1 uL（共 3uL，浓度均为 2mM） 自备的 2mM dTTP/标记 dUTP 混合物（见注）1uL 1 uL Klenow exo 聚合酶 B 型 1 uL Klenow exo 聚合酶 4 uL 超纯水 不需加 dNTP，已经包括在 2×随机引物标记反应液（B 型）中 C 型 1 uL Klenow exo 聚合酶 4 uL 超纯水 不需加 dNTP，已经包括在 2×随机引物标记反应液（C 型）中 注：上表中的 dTTP/标记 dUTP 混合物中 dTTP 和标记的 dUTP 的总浓度为 2mM， dTTP 与标记 dUTP 的比例在 65：35 为佳。但如果使用自备的其他标记核苷酸， 如 fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin 和 aminoallyl 标记的 dUTP，则 用户需要自己摸索其与 dTTP 之间的佳比例，如果使用 32P 标记的 dUTP，则比 活好为 3000Ci/mmol，浓度为好为 10uCi/uL，并且不需要加入 dTTP。

4. 轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心数秒使所有液体集中在管底。

5. 37℃保温 1-20 小时。标记效率跟模板量和保温时间相关，具体见下表： 模版 DNA 用量 （ng） 1 小时后探针合成量 （ng） 20 小时后探针合成量 （ng） 10 80 900 30 150 1350 100 350 1650 300 750 2200 1000 1300 2600 3000 1600 2600

6. 加 1 uL 自备的 0.5M EDTA（pH 8.0）终止反应，加热 100℃ 5 分钟使 DNA 探 针变性成单链，然后直接加入到杂交反应液中即可。如果电泳检测，标记产物将是 弥散状态。立即放冰上待用或放-20℃保存一年。用前需要 注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化， 注意不要用酚抽提法纯化非同位素标记的 DNA 探针，因为这些标记分子疏水性强， 能使标记的 DNA 进入疏水的有机相而丢失，但可以用乙醇沉淀和 Sephadex G50 回收（可另购柱式探针纯化试剂盒，产品编号 121122）。对比活高的同位素标记探 针，由于同位素其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。