一站式柱式miRNAout

一站式柱式miRNAout

产品及特点

本产品是在基因 miRNAout (CAT#:70501)基础上自主开发的柱式升级产品，是目前国内外场上最快速最简单的小 RNA 分离纯化产品。它具有下列特点：

1. 一步法直接分离纯化小 RNA，比两步法（先分离总 RNA 和再纯化其中的小 RNA）和 PAGE 电泳回收法更简单。得到的小 RNA 长度大部分在 200 nt 以下，包括 5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA 和 snRNA 等。

2. 柱式操作，比 miRNAout 更加简单快捷，整个过程只需要十多分钟。

3. 适用范围广，可以用于动物组织、血液及部分植物组织等实验材料。

4. 小 RNA 纯净，OD260/280 一般都在 1.9 以上。

5. 产率一般为 20-40 ug/100 mg 动物组织。

6. 无基因组 DNA 的污染。

7. 可用于 RT-PCR、miRNA 标记、microarray 等后续实验。
规格及成分 成 份 编 号 大包装包装 
柱式 miRNA 纯化溶液 A LM80104a 25 mL 柱式 miRNA 纯化溶液 B LM80104b 25 mL 柱式 miRNA 纯化溶液 C LM80104c 50 mL 离心吸附柱（广口） 60911 50 套 离心吸附柱（窄口） 170606 50 套 miRNA 专用洗柱液 801 04d 50 mL RNA 洗脱液 71207 10 mL 使用手册 80104sc 1 份

运输及保存 常温运输和保存，有效期一年。

自备试剂 氯仿。 

使用方法 

由于离心吸附柱的吸附量限制，本产品每次提取只能处理 100mg 左右的各种组织，可以在 1.5 mL 塑料离心管中。如果处理样品量大，请分成很多相当于微量提取的量进行，最后再收集在一起。

1. 新鲜配制裂解液。将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 的比例混合，然后根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液 A 和溶液 B 混合后必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。

a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每 10 平方厘米细胞中加入 1 mL 新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。

b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每 1-5×106悬浮细胞中加入1 mL 新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是 fibroblasts 或 carcinoma cell，1 mL 新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要超过 1×106个细胞。

c) 对新鲜的动物或植物实体组织：匀浆法：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入 10 mL 或 15 mL 塑料离心管中，每 50-100 mg 组织加1 mL 新鲜配制的裂解液，用剪切式匀浆机匀浆 30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的 DNA），建议组织的使用量不要超过 50 mg/ mL 裂解液，否则十分容易产生 DNA污染。液氮研磨法：将组织在液氮中研磨成粉，然后转移到新配制的裂解液中，震荡混匀。

d) 对在 RNALOCKER等非冻型保存液中保存的动物或植物实体组织组织：先用纸吸去 RNALOCKER液体后再剪切成小块，再按新鲜实体组织的处理方法处理。

2. 将裂解物转移至一个干净的 1.5 mL 塑料离心管中，然后加入 0.2 倍体积的自备氯仿(1 mL 裂解物需 0.2 ml 氯仿)，振荡器上充分振荡混均 30 秒。

3. 12000-15000 g 室温离心 3-5 分钟。

4. 将上清液（约 0.6-0.8 mL）转移到广口的离心吸附柱中。注意：离心后下层有机相和中间层含有 DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和 DNA 污染。为保险起见，可以留下 100 uL 上清液不取。同时吸取上清时缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状 DNA。不要使用专门吸附小 RNA 的窄口离心吸附柱。

5. 12000-15000 g 室温离心半分钟，收集管中的穿透液。大 RNA 及 DNA将与离心吸附柱的膜结合，小 RNA 将存在于穿透液中。但由于离心吸附柱的吸附能力为 40 ug 动物 RNA，20 ug 植物 RNA，所以如果样品中的大 RNA 含量高于上面数值，则需要减少上样量，否则穿透液中将同时含有大 RNA 和小 RNA。如果不减少上样量，也可以将穿透液再次重复上柱以去除大 RNA。由于此时离心吸附柱已经吸附了大 RNA，所以需要提前对离心吸附柱进行预处理（具体步骤见本手册最后的附录）。

6. 在最后得到的不含大 RNA 的穿透液中加等体积的溶液 C，混匀。此时溶液的总体积约 1.5 mL。

7. 先转移约 0.75mL 到窄口的离心吸附柱中，12000-15000 g 室温离心半

分钟，弃收集管中的穿透液。

8. 将上步上柱剩余的样品转移到离心吸附柱中，12000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。

9. 加 0.7mL miRNA 专用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000 g 室温离心半分钟，弃穿透液。

10. 加 0.3mL miRNA 专用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000 g 室温离心半分钟，弃穿透液。此步一般可以省略。

11. 12000-15000 g 室温离心半分钟以甩出残联液体。此步十分重要，否则残留的 miRNA 专用洗柱液会影响 miRNA 的使用。

12. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free收集管中，加入30-50uL RNA洗脱液，室温放置 3-5 分钟。

13. 12000-15000 g 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 miRNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。附录：宽口离心吸附柱反复上样去除大 RNA 的流程

1. 将结合有大RNA和DNA的宽口离心吸附柱中加入0.1mL自备的超纯水,12000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集液。

2. 再加 0.1mL 自备的超纯水，重复上步一次。

3. 将第 5 步的得到、需要进一步去除其中大 RNA 和 DNA 污染的穿透液直接上柱，12000-15000 g 室温离心半分钟，收集穿透液（此穿透液含小RNA）。

4. 如果大 RNA 已经去干净，可以直接进入第 6 步。一般样品只需要额外处理一次就可以去除全部的大 RNA 污染。