可调式易错PCR试剂盒

可调式易错PCR试剂盒
产品及特点易错 PCR（error-prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的 dNTP 浓度、Mg 浓度和 MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。易错 PCR 和常规 PCR的比较如下：

本产品是在本公司的易错 PCR 试剂盒基础上改进而得，本产品具有下列特点：

1. 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。

2. 配方经过精心优化，实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮 PCR 的突变率范围在 2-8突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮 PCR 达到。

3. 可用于连续易错 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。

4. 可以扩增的 DNA 片段更长，达到 2kb，对于 2kb 以上的产物，建议分段扩增。

5. 本试剂盒足够 100 次 30uL 体系的易错 PCR。

可调式易错PCR试剂盒运输及保存 低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。 

自备试剂 引物、DNA 模板、常规 PCR 试剂盒。

使用方法1. 将引物稀释到 10uM。引物也是决定易错 PCR 成败的关键因素，设计引物时要保证其 Tm在 70℃，长度在 25-30nt 之间，GC 含量在 45%-60%之间，3 端 GC 含量低，并且没有发夹结构。

2. 用自备易错 PCR 引物和常规 PCR 试剂扩增制备易错 DNA 模板（常规 PCR 产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错 PCR 的模板一定要用胶回收的常规 PCR 产物，因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错 PCR 引物扩增所得，在易错 PCR 扩增时也会扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。如果常规 PCR 制备模板的引物和易错 PCR 引物不同（类似巢式 PCR）则可以避免此问题，但需要合成两对引物。

3. 将回收的 DNA 片段（模板）稀释到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三个浓度。注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，模板 DNA 为非突变 DNA，扩增产生的 DNA 为突变 DNA，易错 PCR 体系最终 DNA 量是基本固定的，因此模板 DNA 使用量越大，则突变 DNA 在终产物中的相对比例就越低，突变率就越低。反之亦然。但模板太少又不容易扩增成功，所以建议同时测试两个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的 PCR 产物进行分析。

4. 根据每 1000bp 的预期突变数按下表确定 30uL 易错 PCR 体系中 MnCl2和 dGTP 的用量（这是在模板DNA不超过1ng的前提下的数据）。表中的Mn表示易错PCR专用的MnCl2,dG 表示易错 PCR 专用的 dGTP：

预期突变数 2 个 3 个 4 个 5 个 6 个 7 个 8 个

Mn 用量（uL） 0 1.0 2.5 4.0 4.0 4.0 4.0

dG 用量（uL） 0 0 0 1.0 2.0 3.0 4.0

5. 次建议设置 3 个模板浓度。在 3 干净的 PCR 管中，分别加入下列成分（这里是设置30uL 的反应体系，如果反应体系不是 30 uL，则各成分用量需要按等比例增加或减少）：

成分 模板用量 1 模板用量 2 模板用量 3

易错 PCR Mix, 10× 3 uL 3 uL 3 uL

易错 PCR 专用 dNTP,

10×

3 uL 3 uL 3 uL

易错 PCR 专用 MnCl2 根据上步计算 根据上步计算 根据上步计算

易错 PCR 专用 dGTP 根据上步计算 根据上步计算 根据上步计算

自备 DNA 模板 1 uL 1 uL 1 uL

（1ng/uL） （10ng/uL） （100ng/uL）

自备 PCR 引物

(10 uM each) 1 uL each 1 uL each 1 uL each

易错 PCR 专用

Taq DNA 聚合酶 0.5 uL 0.5 uL 0.5 uL

超纯水 补水到 30uL 补水到 30uL 补水到 30uL

6. 按已经优化的常规 PCR 条件进行易错 PCR：

PCR 前变性 94℃ 3 分钟

易错 PCR(循环 30-60 次)

94℃ 1 分钟

45℃ 1 分钟

72℃ 1 分钟（对 1Kb 长的模板）

注：易错 PCR 一般不需要热启动，也不需要在 PCR 结束后做延伸处理。长度每增加 1Kb，时间延长 1分钟。易错 PCR 循环次数越多，突变 DNA（扩增产物）与非突变 DNA（模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多，所以次实验时做 30、35、40、45、50、55、60 次 7 个循环数的比较。

7. 电泳检测是否得到预计长度的 PCR 产物。如果没有，可以调整模板用量和 PCR 参数。

8. 胶回收易错 PCR 扩增产物、克隆并对单菌落进行功能筛选或测序分析、如果需要增加突变率，可以以突变后的 DNA 为模板，进行下一轮易错 PCR。